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叉鞭金藻多糖的分离纯化及体外抗氧化作用研究 周 妍，王 凌，孙利芹，王长海 (烟台大学海洋学院，山东烟台264005) 摘要：叉鞭金藻多糖(DAP)经琼脂糖凝胶柱层析进行分级，得到了DAP一1和DAP一2 2个组分，分别对这2个组分进行了纯度和分子质量的测定，并考察了对羟自由基OH·、 超氧阴离子O ·的清除效果，以及对H：O：诱发小鼠红细胞氧化溶血的抑制作用和对小 鼠肝匀浆脂质过氧化的抑制作用．结果显示，两个组份的组成相对均一，能显著或极显著 清除OH·、O ·，抑制小鼠红细胞溶血，并能显著抑制小鼠肝脂质过氧化的产生，且呈 现剂量依赖性．其中DAP一2的抗氧化活性较DAP—l好，其对OH·、0 ·的清除率最 高可达85．2％ 和76．0％ ，对小鼠红细胞的溶血抑制率和脂质过氧化的抑制率分别可达 83．6％ 和89．3％ ． 关键词：叉鞭金藻；多糖；分离纯化；抗氧化 中图分类号：Q949．2 文献标识码：A 随着陆地资源的逐渐枯竭，人们逐渐将研究 方向转向海洋，从海洋生物中寻求新的天然抗氧 化剂、新的抗衰老药物等已成为医药、食品等领域 的重要目标．叉鞭金藻(Dicrateria sp．)是一种经 济价值较高的海洋单细胞微藻，广泛用于虾、贻 贝、牡蛎等多种海珍品的人工养殖¨ ．目前对叉 鞭金藻的研究主要集中在：(1)高密度培养的研 究，以生物量形式作为饵料的应用；(2)用作污水 处理中的cu¨、Pb 等有害金属离子的生物吸附 剂；(3)有机磷农药对其生长繁殖抑制机制的研 究，从而进一步研究海洋微藻的致毒性 J．此外 对于叉鞭金藻活性物质的研究中对其合成不饱和 脂肪酸的研究较多，而对于其多糖研究的报道很 少，多数仅停留在多糖含量的测定上．本文从叉鞭 金藻多糖的提取纯化人手，获得不同组分的多糖 并对其体外抗氧化作用进行研究，以期为叉鞭金 藻多糖作为食品添加剂或海洋药物的开发提供一 定的参考． 1 材料与方法 1．1 材料与仪器 叉鞭金藻(Dicrateria sp．)原种购于中国海洋 大学种质库，实验用藻种由烟台大学海洋生化研 究所纯化并保存． 药品：邻苯三酚，国药集团化学试剂有限公 司；邻二氮菲，天津市大茂化学试剂厂；三羟甲基 氨基甲烷(Tris)，Sanland—ehem International Inc； H O ，天津市大茂化学试剂厂；七水和硫酸亚铁， 烟台三和化学试剂有限公司；硫代巴比妥酸 (TBA)，上海试剂二厂．以上试剂均为分析纯． 清洁级昆明种小鼠，雄性，体重20～22 g，山 东绿叶制药有限公司(许可证号：SYXK(鲁)． 主要仪器：UV1601紫外可见分光光度计，日 本SHIMAZU公司产品；BSZ一100自动部分收集 器，上海沪西分析仪器厂；HL一2S恒流泵，上海沪 收稿日期：2009-07—13 资助项目：山东省自然科学基金资助项目(Y2007D59)；烟台大学大学生科技创新基金资助项目(080605)． 作者简介：周妍(1985一)，女，山东东营人，硕士研究生，研究方向：海洋活性物质；通讯联系人：王长海(chwang2001 @sina．tom)，教授，博士生导师． 290 烟台大学学报(自然科学与工程版) 第23卷 西分析仪器厂；Agilent 1 100型高效液相色谱仪， 美国安捷伦科技有限公司． 1．2 方法 1．2．1 叉鞭金藻粗多糖的制备新鲜培养的叉 鞭金藻藻液经离心后，加入5倍体积的去离子水， 置于一4℃冷冻，然后取出融化，如此反复3次获 得水溶性提取物；将冻融后的溶液超声破碎，离心 10 rain，取上清液在水浴中加热，浓缩至原体积的 1／3，加人体积分数为3％ 的三氯乙酸沉淀蛋白， 12000 r／min离心10 rain，取上清液；加入5倍体 积的95％ 乙醇，离心取沉淀洗涤、透析、冷冻干燥 得白色粉末为粗多糖DAP L3 J． 1．2．2 粗多糖的分级与纯化将叉鞭金藻粗多 糖DAP配成5 mg／mL的水溶液，上平衡好的 Sepharose 6B琼脂糖凝胶层析柱(3．5 cm×80 era)．用0．O1 mol／L的NaC1溶液梯度洗脱，流速 0．6 mL／min，按管收集，用硫 葸酮法于620 nm 处检测糖的吸光度，得到多糖的洗脱曲线．根据洗 脱曲线分段收集，合并相同组分，浓缩，加人5倍 体积的95％ 乙醇使其完全沉淀，离心收集沉淀， 加蒸馏水，透析脱盐，冷冻干燥即得多糖精品． 1．2．3 多糖纯度和分子量检测将DAP制成 0．2％ 的溶液，经0．22 m滤膜过滤后，取滤液20 注入液相色谱仪，色谱柱为TSKGel一4000Pw 凝胶色谱柱(10 m，7．5 mm×300 mm)，流动相 为双蒸水，流速为0．5 mL／min，示差检测器温度 为35℃，分析时间为