传染病检测SOP工作手册-霍乱弧菌.docVIP

PAGE  霍乱弧菌实验室检测SOP手册 标本的采集和送检 标本的采集：采集标本的好坏，对检验工作的质量影响很大。为尽快获得细检查结果，应在发病早期、在服用抗菌药物之前尽快采集标本和及时送到检验室。 标本以病人大便为主。采便方法用灭菌的棉拭采集排出的新鲜大便，亦可用直肠棉拭或用采便管由肛门插入 3㎝～5㎝采集。一般要求水样便采集1ml～3ml，固形便采取蚕豆大小粪量。有时病人的呕吐物、沾染大便的衣物和尸体的肠内容物亦可作为检材。带菌者的大便可用棉拭或直肠棉拭采取。 标本的送检：采取的标本应立即接种培养基，典型病人的水样便含有大量病菌（106/ml～109/ml），可直接做分离培养并同时增菌培养。不需做直接分离的均可接种碱性蛋白胨水增菌。并立即送检验室。 标本运送途中较远，也可将标本放入文腊氏保存液或卡里—布莱尔运送培养基。标本与保存液的比例为8ml～10ml保存液加1ml～3ml水样便或蚕豆大的固形便。也可用厚吸墨纸条吸饱水样便放入小塑料袋内封好送检。 送检标本时，必须认真填写送检单，标本必须妥善包装，专人送检，并防止污染，注意安全，送检箱用后要严密消毒。 检验方法 培养方法 增菌培养：所有标本都应经过增菌，尤其是恢复期病人、带菌者或用过抗生素的病人标本，需增菌后再分离。碱胨水接种后放37℃6～8小时，夏日可将运送时间计算在内。保存液内的标本取1ml种入碱胨水中。培养后慢慢地从碱胨水生长的菌膜下，取一接种环表层培养物接种于4号或庆大霉素琼脂平板。 标本含菌少时，可实行二次增菌。取第一次碱胨水增菌后的表层液0.1～0.2ml，接种于另一碱胨水中，37℃6～8小时再做分离。 分离培养：急性典型病人标本在增菌的同时直接做分离培养，这样既可缩短检出的时间，还可避免标本中如有不凝集弧菌经增菌后大量繁殖，影响霍乱弧菌的分离。其它标本均应增菌后再做分离培养。当前的习惯多为碱性蛋白胨水增菌，再用强选择性培养基分离，37℃12～16小时长出的菌落，可供做玻片凝集用。 血清凝集：选择生长16小时的圆形、扁平、光滑、湿润、半透明、稍隆起、略带青灰色或中心变黑的菌落、如在TCBS琼脂上为黄色菌落3～5个与霍乱O1群多价血清做玻片凝集试验。30秒内出现肉眼可见的明显凝集为阳性。凝集的菌落应以生理盐水排除自凝并用单价血清分型。 对菌落典型O1群血清不凝者，可用O139群霍乱血清做凝集试验，有阳性者要立即报告。在流行后期可能出现O1群粗糙型，应该用粗糙型血清做凝集试验。 已凝集的菌落应及时转种普通琼脂斜面或半固体琼脂，以备进一步鉴定和保留菌种。对现有霍乱诊断血清不凝集的，凡粘丝试验或氧化酶试验阳性，确定为弧菌者，亦可保留菌种上送。 血清分型：方法是用小川型和稻叶型单价血清作玻片凝集试验。凡与小川型血清凝集，与稻叶型血清不凝集者为小川型；反之为稻叶型，在两个单价血清中都有明显凝集者为彦岛型。应注意小川型菌株型有时在稻叶型单价血清中出现弱凝集，不要误认为是彦岛型。必要时应以两个单价血清的试管凝集滴度确定彦岛型。 试管凝集试验：将霍乱多价诊断血清用生理盐水自1:20起倍比稀释，每管含稀释血清0.25ml。然后将被检菌的16～24小时普通琼脂培养物，制成0.2%福尔马林生理盐水悬液，每毫升含20亿菌体，各血清稀释管均加入0.25ml。摇匀，置37℃3小时观察初步结果，再放室温过夜，观察最后结果。通常以肉眼明显看出凝集（++）的血清最高稀释倍数为凝集滴度，生理盐水对照不应有自凝。 形态学检查：按常法涂片进行革兰氏染色，霍乱弧菌均为革兰氏阴性弧菌。用悬滴或暗视野检查动力呈穿梭状。用半固体琼脂穿刺培养基检查动力，37℃16～20小时霍乱弧菌沿穿刺线扩散生长，为动力阳性。急性典型病人米泔样大便的絮片压片，干燥后甲醇固定，用1:10稀释石炭酸复红染色，可见弧菌呈鱼群状排列。 生化学检查：将被检菌的纯培养接种入葡萄糖、甘露糖、蔗糖、阿拉伯糖发酵管、蛋白胨水和硝酸盐胨水管中。 鉴定标准和诊断报告：霍乱弧菌以血清学鉴定为主，结合菌落特征、形态学和生化性状做出判定。凡具备弧菌菌落特征，与O1群霍乱多价血清玻片凝集阳性，并可用单价血清分型，即可判定。首发病例可以辅以粘丝试验和氧化酶试验，必要时再做其它试验。进一步鉴定O1群霍乱弧菌，还要做古典型和埃尔托型的鉴别及噬菌体型的鉴别。 O1群霍乱弧菌的检验报告要求迅速准确，基层单位在收到检验标本后应按疑似病人、 带菌调查、外环境标本分别登记编号，并迅速放入温箱培养。一般上午收到标本，下午下班前可做分离培养，次日上午可报告结果。典型病人水样便，增菌同时做直接分离，可提前报告结果，首例病人菌株需送上一级实验室鉴定和复核。首例病人确诊后再检出的菌株，经血清凝集结合菌落形态即可确诊。 菌株的保存：对所检获的阳性菌种或可疑菌种，均应接种半固体