5.2微生物细胞破碎-5.3pro复性课程.pptVIP

细胞破碎; 几种产品在发酵液中的浓度 产品 典型浓度（g/L） 抗生素 25 氨基酸 100 酒精 100 有机酸 100 酶 20 蛋白质 10;下游加工技术的特点: 1. 发酵液的复杂性造成分离上的困难性; 2. 欲提取的产物通常浓度低且很不稳定; 3. 多为分批操作，各批发酵液不尽相同，要求下游加工有一定弹性。;产物提纯过程的不同决定于： 对象材料 目标产物特性 对其纯度的要求;基因工程生物制品分离纯化:;;初级分离：分离细胞和培养液，破碎细胞释放产物，溶解包含体（包涵体），复原蛋白质，浓缩产物，去除大部分杂质等过程。主要决定产物的得率。 纯化精制：初级分离基础上，用各种高选择性手段，主要是各种层析技术，将目标产物和干扰杂质尽可能分开，使产物的纯度达到有关要求。主要决定产物的纯度。;总原则： 控制时间、温度、pH值，减少与空气接触的机会，设计好各组分的分离顺序.;第二节 细胞破碎;酶;药物名;细胞壁的组成与结构; 图1 革兰氏菌细胞壁结构图 （a）革兰氏阳性菌 （b）革兰氏阴性菌; 图2 酵母细胞壁的结构示意图 M—甘露聚糖； P—磷酸二酯键； G—葡聚糖; 微生物细胞壁的形状、强度取决于细胞壁的组成以及它们之间相互关联的程度。 内因：连接细胞壁网状结构的共价键; 外因：各类微生物的遗传信息、培养条件、菌龄、外界环境等。 ;破碎程度的评价;N0和N的确定方法： 直接计数法：通过平板计数技术或血球细胞器上用显微镜观察，直接对适当稀释后的样品进行计数。 间接计数法：在细胞破碎后，测定悬浮液中细胞释放出来的化合物的量（eg.可溶性蛋白、酶等）。;细胞破碎技术;其他新的细胞破碎方法：;细胞;常用的破壁方法;1、常用的破壁方法——珠磨法;几种常见珠磨器; 破碎作用遵循一级动力学定律： ; 破碎的速率和效率是所有操作参数的函数，如：珠体的大小、珠体的装量、细胞浓度、操作温度、料液性质、搅拌器转速与构型等。 此外，与搅拌器的设计和研磨腔的结构也有关系，如转盘外缘速度等。; 一般来说，磨珠越小，细胞破碎速度越快，但太小易于漂浮，并难以保留在研磨机的腔体中。通常实验室规模，珠体直径为0.2mm较好，工业规模不得小于0.4mm。 ; 有研究表明，减小磨珠直径起先会提高卡乐酵母蛋白质的释放速度，但磨珠再小一些，蛋白质的释放速度反而稍有下降。 eg.从酵母细胞中提取D-葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，最好使用0.55-0.85mm大小的玻璃珠，而在提取α-D-葡萄糖苷酶时，则最好使用较大尺寸（如1mm直径）磨珠。; 在一定范围内，增加珠体装填量可以提高细胞破碎率。但超过某一限度时，反不利于细胞破碎和蛋白质的释放。 为消除这种影响，必须提高搅拌器的功率，这样又会增大释放的热量，给破碎带来困难。 一般研磨机腔体内的填充密度控制在80%-90%，并随珠体大小变化。; 细胞浓度对悬浮液的流变特性具有影响，最佳的细胞浓度应用实验来确定。一般用Netzsch(耐池）LM20研磨机破碎时，细胞浓度控制在40%左右。; Currie等人的研究表明，操作温度控制在5-400C范围内对破碎物的影响较小。 常采用冷却夹套和搅拌轴的方式来调节磨室的温度。;2、常用的破壁方法——高压匀浆;;;高压匀浆法动力学方程; 此方法中影响破碎的主要因素是压力、温度和通过匀浆器的次数。 有研究表明，当悬浮液中酵母浓度在450-750kg/m3时，温度由500C变为300C，破碎率约提高1.5倍。 ;图7　细胞浓度及压力大小对破碎率的影响 ;破碎率---操作压力----温度控制----能耗 温度对活性物质的失活作用 提高压力需增加能耗：3.5KW/100MPa 移走热量需付出代价 ;堵塞（不适合团块状或丝状真菌），质地坚硬者如包含体易损伤匀浆阀，也不适用； 温度高易失活，能耗大。;高压匀浆法与高速珠磨法的比较;3、常用的破壁方法——超声波破碎;空化现象：在强声波作用下，引起气泡形成，胀大和破碎的现象。; 超声波振动在液体中传播的音波压强达到1atm时，功率密度为0.35 w/cm2，这时超声波的音波压强峰值可达真空或负