2分子杂交重点.pptVIP

转基因水稻外源基因拷贝数检测;Southern Blotting;实验原理;12;植物总DNA的快速少量抽提（CTAB法）;保证核酸一级结构的完整性（30－50 Kb）； 排除其它分子的污染?。;CTAB（十六烷基三甲基溴化铵 ）是一种非离子去污剂，CTAB与核酸形成复合物，此复合物在高盐（0.7mM）浓度下可溶，并稳定存在，但在低盐浓度（0.1-0.5mM NaCl）下CTAB-核酸复合物就因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。经离心弃上清后，CTAB-核酸复合物再用70－75%酒精浸泡可洗脱掉CTAB。;操作步骤; 10000rpm离心5分钟； 吸取450?l上清于新的1.5ml离心管，加入两倍体积95％乙醇，上下颠倒至絮状沉淀出现； 12000rpm离心10分钟； 弃去上清。用1000?l 75％乙醇浸洗沉淀5分钟，除去离子及CTAB残余，弃上清,自然干燥； 加入50?l TE（含20?g/ml RNaseA），放于25oC溶解、待用。 充分溶解后，测定浓度。;1．尽量取材幼嫩叶片，如太老，酚类物质多，必须用10mM的β-ME处理； 2．研钵预冻，粉末转管前至加CTAB前不要融化； 3．24:1的苯酚氯仿抽提时动作应轻柔，氯仿的操作要在通风柜中进行； 4．所用试剂必需灭菌，手套。 思考： （1）试分析DNA降解的可能原因 （2）提高DNA产量的措施;氯仿/异戊醇（24:1）：氯仿是有机溶剂，去除植物色素、蛋白质和多糖等，异戊醇可减少蛋白质变性过程中气泡的产生，配合使用两有机溶剂，比用单一有机溶剂去除蛋白质更有效； DNA沉淀：无水或95％的乙醇，或异丙醇； 3M NaAC (或10M NH4AC） 协助乙醇沉淀DNA； 75%乙醇去除微量Na+、K+、Mg2+等阳离子及小分子量的有机分子，洗脱CTAB。;TE（1mM EDTA，10mM Tris.HCl pH8.0）溶解并长期保存DNA。EDTA螯合Mg2+、Ca2+等二价阳离子，从而抑制DNase等的活性。 1.5 ×CTAB CTAB 15 g 1 M Tris·Cl (pH 8.0) 75 ml 0.5 M EDTA 30 ml NaCl 61.4 g Add ddH2O to 1000 ml ;;Hoechst33258:可与纳克级的DNA结合，而几乎没有RNA亲和性，激发波长365nm，发射波长460nm。0.1μg/ml Hoechst33258适用于检测500ng/ml的DNA浓度，染料增加到1μg/ml，分析范围可延至15μg/ml，但会降低一定的灵敏度。 缺点：更易于结合AT丰富区，对DNA组成敏感。 EB:与DNA组成无关，但不如Hoechst33258敏感，且能结合RNA，激发波长302nm，发射波长590nm。;琼脂糖凝胶电泳 ;在pH值为8.0－8.3时，核酸分子带负电，在电泳时由负极向正极移动。采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物，在分子筛的作用下，使分子大小和构像不同的核酸分子泳动率出现较大的差异，从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。 核酸分子中嵌入荧光染料（如EB）后，在紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。;影响DNA迁移速率的因素 ;DNA构象：一般迁移速率超螺旋环状线状DNA单链开环。当条件变化时，情况会相反，还与琼脂糖的浓度、电流强度、离子强度及EB含量有关。 碱基组成与温度：一般影响不大，4 -30 ℃。 嵌入染料的存在：降低迁移率，(不提倡加在电泳液中) 电泳缓冲液的组成及其离子强度：影响DNA的迁移率，无离子存在时，核酸基本不泳动；离子强度过大产热厉害，熔化凝胶并导致DNA变性，一般采用1×TAE，0.5×TBE，1×TPE（均含EDTA pH8.0） ;实验步骤;将电泳样品与上样缓冲液混合后将样品依次点入加样孔中； 将制胶板放入电泳槽中，加入电泳液，打开电泳仪，使核酸样品向正极泳动（注意点样孔在电泳槽的负极一端）； 电泳完成后切断电源，取出凝胶，放入0.5 μg/ml的溴化乙锭（EB）中浸泡10－15 min，在紫外透射仪上观察电泳结果并照相记录。;电泳指示剂：核酸电泳常用的指示剂有两种:溴酚蓝（bromophenol blue, Bb）呈蓝紫