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第5章 利用酵母菌生产蛋白质 ;酵母细胞模式图;细菌细胞;外源蛋白表达系统;外源蛋白表达系统;外源蛋白表达系统;蛋白质表达系统的选择; 原核表达系统与真核表达系统的比较： （1）区域化 原核生物：细胞质 真核生物： 内质网：大部分蛋白 内质网-高尔基体：分泌性蛋白 ① 氧化还原电位低－氧化型环境； ② 二硫化物异构酶； ③ 辅助蛋白（折叠酶；分子伴侣chaperonine） ; 在细菌中合成生产的真核生物蛋白由于缺乏翻译后加工过程，往往导致失去生物活性。 真核生物翻译后修饰作用： ① 形成正确的二硫键。 由二硫键异构酶催化完成。蛋白质折叠所必需，否则不能正确折叠的蛋白质不稳定，且失去生物学活性。 ;一级结构; ② 切割前体。 前体蛋白中的???些氨基酸序列如信号肽的切出，形成有功能的蛋白质。 ③ 蛋白质的糖基化。 是将寡糖连接到一个蛋白质分子上，是真核生物细胞表达基因产物时最重要的一种翻译后修饰作用。 作用： i. 有利于保证所表达的蛋白质进行适当的折叠； ii. 保护蛋白质免受细胞蛋白酶的降解。 最常见的是O-糖基化（加在Ser, Thr上）和N-糖基化（加在Asn上）。酵母菌中的寡糖通常含有大量的甘露糖残基。;多糖和蛋白质在细胞壁上的连接方式;;一般酵母菌中的寡糖; ④ 对氨基酸的修饰作用。 包括磷酸化、甲基化、乙酰化、硫酸化、丙烯酸化、?羧酸化、豆蔻酸化及软脂酰化等。 ;在原核生物中，可分泌蛋白质是由N末端信号序列控制合成的，然后通过细胞膜上的“SecY-SecD-SecE-SecF”组成的蛋白质复合物分泌出去。;在酵母菌中，分泌蛋白的信号序列为信号识别颗粒（SRF）所识别。SRF包含6种蛋白质分子，并由一个小的RNA分子将其串连在一起。通过SRF与其在膜表面上的受体之间的识别与结合，引导新生蛋白到达蛋白质的输出结构，该结构位于粗糙内质网的特异性位点上。;;在原核生物中LPS的产生。LPS的毒性； 酵母菌：细胞组分和代谢物对人体是安全的。;;2、酿酒酵母基因组结构及其特点 1996年 完成全长为12Mb酿酒酵母基因组的测序。 酿酒酵母是一种重要的模式生物，也是第一个被测序的真核生物。它有16条染色体，基因组全长为12Mb，含有6000多个基因。它的基因组的测序是作为HGP的一部分于上世纪80年代末期启动，于1996年完成。1997年《Nature》专门为酿酒酵母基因组发行了增刊。 ;酿酒酵母的基因组很小，仅有16条染色体。;基因组全长12068kb，有5885个编码专一性蛋白质的开放阅读框。酵母基因组中平均每隔2kb就存在一个编码蛋白质的基因，即整个基因组有72％的核苷酸顺序由开放阅读框组成。 酵母基因组的基因间隔区较短，基因中内含子稀少。其开放阅读框平均长度为1450bp即483个密码子，最长的是位于XII号染色体上的一个功能未知的开放阅读框(4910个密码子)，还有极少数的开放阅读框长度超过1500个密码子。 酵母基因组中还包含：约140个编码RNA的基因，排列在XII号染色体的长末端； 40个编码snRNA的基因，散布于16条染色体； 属于43个家族的275个tRNA基因也广泛分布于基因组中。;酿酒酵母基因组的结构;2.2 酵母菌基因组结构的特征;S. cerevisiae基因组的测序被称为现代分子生物学历史上最为分散的实验。包括美国、加拿大、欧洲、日本等国家在内的100多个实验室，超过600多名科学家都参与了这项工作。 酵母菌研究社群(the yeast community)，在Andre Goffeau教授(the Universite Catholique de Louvain in Belgium)的领导下，树立了一个效率，合作，组织的典范。这样一种国际合作也是基因组学研究的一个重要特点。;;3、酿酒酵母基因表达系统 酿酒酵母作为受体菌的优势： （1）为单细胞真核生物，对其遗传学和生理学的研究较为深入； （2）能快速生长； （3）具有启动活性强的酵母基因启动子； （4）具有内源表达载体和众多的商业化载体（如Invitrogen）； （5）可以对所表达的蛋白质进行多种翻译后修饰； （6）其自然分泌的蛋白质很少