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使用ionKey/MS系统提升人血浆中治疗性内源性多肽的定量检测方法的灵敏度、减少样本量 应用优势 高灵敏度的定量限小于1 pg/mL，仅需100 μL血浆样本量 使用ionKey/MS，样本量仅需25 μL，检出限就可以达到2.5 pg/mL 使用混合模式的故乡萃取SPE技术进行前处理，减少了基质的干扰，提高了血浆提取的选择性 96孔板洗脱可以浓缩样品浓度：增加溶解度和使样品吸附损失减少到最低。 选择性，迅捷的SPE提取（少于30分钟）耗时短，免疫亲和纯化。 相比2.1 mm的色谱柱柱径，iKey减少了40倍的溶剂消耗，节省了极大的成本 沃特世解决方案 ionKey/MSR系统 ACQUITY UPLCR M-Class IonKey?源 XevoR TQ-S质谱仪 iKey? 分离装置 OasisR WCX 96孔μElution板 ACQUITYR采集板 MassLynx? v. 4.1 关键词 生物分析，生物分析，Oasis，样品配制，肽定量，去氨加压素，血管加压素，奥曲肽，UPLC，二维技术，血浆，ionKey/MS，iKey 介绍 近年来，使用肽和蛋白质作为治疗药物显著地增加，因此,对毒性动力学和药代动力学的研究分析需要也越来越多。 以往，生物样品使用配体结合实验分析。然而，随着质谱的发展，液相色谱技术联用质谱定量测定生物液体样品中多肽的方法得到开发。由于LBA方法容易受交叉反应因素影响并缺少标准。此外，LC/MS/MS也拥有更高的准确度和精密度，宽广的动态范围，特异性，迅捷的方法开发等优势。然而，使用LC/MS/MS精准定量多肽也不是没有自身的挑战的。肽有不同的药物动力学，通常是较低的循环血浆水平（pg/mL），较低的质谱灵敏度，需要与同分异构的内源性干扰物一定的色谱分离度。因此，为了得到低至pg/mL水平的定量限，通常要求大量样品体积（0.2-1 mL）以及大体积的进样量。在研究开发过程中获得这些大体积样本是不切实际的。因此，在保持或者提升灵敏度的同时，减少对定量测定生物样品所需要的样本量。 本次研究改善灵敏度和减少样品体积需求的治疗性内源性循环多肽有：去氨加压素，血管加压素，奥曲肽。 这些肽的一般特性如表1所示。使用选择性结合的μElution混合型SPE进行样品前处理，选择最佳的MS母离子和碎片离子，ionKey/MS/系统（离子源如图1所示），这样就可以达到血浆中1 pg/mL的定量限。利用ionKey/MS系统有助于将所需血浆样本的量减少到25-100 μL。 实验 方法条件 UPLC条件 系统： ACQUITY UPLCR M-Class，捕集器和反冲洗 洗脱配置 设备 色谱柱： HSS T3，1.7 μm，130 A, 150 μm×50 mm iKey （p/n 720007261EN） 捕集色谱柱：ACQUITY UPLC M-Class Symmetry C18, 5 μm, 300 μm x 50 mm (p/n 720007498EN) 流动相A： 0.1%甲酸水 流动相B： 0.1%甲酸乙腈 上样溶剂： 98:2流动相A:B， 25 μL/min持续头2分钟， 阀切换 阀位置： 初始位置1（上样至捕集 器），在2分钟时改为位 置2（反冲洗洗脱捕集器 到分析色谱柱上） 分析梯度： 见表2 洗脱流速： 3.0 μL/min 色谱柱温度： 75 ℃ 样品温度： 15 ℃ 进样体积： 5 μL 总运行时间： 12.0分钟 采集板： 沃特世1 mL ACQUITY采集板 质谱条件 系统： Xevo TQ-S 离子化模式： ESI正离子 毛细管电压： 3.8 kV 源温度： 120 ℃ 锥孔反吹气流量： 100 L/ hr 碰撞池压力： 5.5×10(-3) mbar 碰撞能量： 按成分进行优化，请参见表3 进样锥电压： 按成分进行优化，请参见表3 数据管理 谱图软件： MassLynxR 4.1 定量软件： TargetLynx? 表 1. 肽的化学性质 肽氨基酸序列质荷比等电点HPLC指数奥曲肽8苯丙氨酸-半胱氨酸-苯丙氨酸-色氨酸-赖氨酸-苏氨酸-半胱氨酸-ol（二硫键2-7）10199.340.8去氨加压素Mpa-酪氨酸-色氨酸-苯丙氨酸-谷氨酰胺-天冬酰胺-半胱氨酸-脯氨酸-精氨酸-甘氨酸-氨基（二硫键1-6）10698.616.8血管加压素半胱氨酸-酪氨酸-苯丙氨酸-谷氨酸-天冬氨酸-半胱氨酸-脯氨酸-精氨酸-甘氨酸-氨基（二硫键1-6）10849.17.6 梯度时间（分钟）组成%A组成%B曲线0.098265.0505065.5505067.0109068.010906