抗体分泌细胞的检测.docVIP

抗体分泌细胞的检测 伍国强 兰州大学草业学院 兰州 730020 摘要： 本实验采用定量溶血分光光度测定法 quantitative hemolysis spectrophotometry , QHS 检测抗体分泌细胞。经绵羊红细胞 SRBC 免疫的小鼠脾脏细胞的浓度明显高于对照。 关键词 ：绵羊红细胞（SRBC）； 脾细胞 ； 补体反应 1 前言 定量溶血分光光度测定法 quantitative hemolysis spectrophotometry , QHS 又称作B淋巴细胞介导红细胞定量溶血的分光光度法，是体外检查产生IgM的抗体生成细胞的常用方法 之一.取经绵羊红细胞 SRBC 免疫的小鼠脾脏细胞,加入SRBC和补体,37℃孵育后,取上清液分光光度计比色,根据一定量的抗体生成细胞产生和分泌的抗体裂解红细胞后释放的血红蛋白量 OD值表示 ,来反映机体的体液免疫功能状态. 2 材料与方法 2.1、材料和仪器 2.1.1、材料（1）、小白鼠 20~22g ，（2）、豚鼠新鲜血清 1:10hank`s液稀释 ，（3）、绵羊红细胞 SRBC ：保存于阿氏液中，使用前配成0.2%浓度pH7.2hank`s液,4℃冰箱备用， 4 0.1%HAc无菌生理盐水，（5）酒精棉球等。 2.1.2、仪器 离心管（8个），小烧杯 2个 ，镊子，剪刀，玻璃板，注射器，内铺8层纱布的小漏斗，722分光光度计，血球计数板，计数器，显微镜，吸管，离心机，水浴锅等。 2.2、方法 2.2.1、绵羊红血球的制备 无菌自绵羊静脉取血，玻璃珠脱纤维抗凝。然后，10mlAlsever液+10ml绵羊血，4℃冰箱保存。取上述稀释一倍的血1ml+5ml Hanks液，2000rpm 15 min，弃去上清，沉淀洗2次后用Hanks稀释成10%SRBC溶液。 2.2.2、补体的制备 豚鼠血清+等量血液的绵羊红细胞，振荡，混匀。放4℃，20-30 min。然后2000rpm离心5 min ，取上清，弃沉淀。将上清用Hanks液稀释10倍。 2.2.3、脾细胞悬液的制备 （1）、小鼠眼眶放血，断颈处死，取出脾脏，放入冰浴的小烧杯中加3ml Hanks液，用剪刀剪碎，然后用5ml注射器吹打使细胞分散成均匀悬液，用纱布（纱布用Hanks液润湿）过滤，取滤液2000rpm离心5 min ,沉淀以3ml冷的Hanks悬浮。 （2）取1滴脾细胞悬液，用4滴0.1%HAc固定，然后对被固定的脾细胞计数。 （3）显微计数 细胞个数/ml 4个大格总数/4 ×104×5，然后用Hanks液调整细胞个数为5×106个/ml。 2.2.4、补体反应 （1）实验组：0.5ml脾细胞 实验组 +0.5ml0.2%SRBC+0.5ml补体 （2）对照组：0.5ml脾细胞 对照组 +0.5ml0.2%SRBC+0.5ml补体 （3）空白组：0.5ml脾细胞 对照组 +0.5ml0.2%SRBC+0.5ml Hanks 37℃水浴中温育1h 保温时防止水浴锅的水进入反应体系 后，2000rpm离心5min，取上清，在722分光光度计413nm波长测OD值。 3、结果与讨论 表：小鼠脾脏细胞悬浮液浓度及补体反应后的OD 细胞个数（个） 浓度 个/ml OD值 对照组 1925 1.6×107 0.679 实验组 1288 2.4×107 1.401 3.1、经绵羊红细胞 SRBC 免疫的小鼠脾脏细胞浓度高。 从上表可以看出，经绵羊红细胞 SRBC 免疫的小鼠脾脏细胞浓度2.4×107较对照浓度1.6×107高。 3.2、抗体裂解红细胞后释放的血红蛋白量 OD值 大。 从上表可以看出，经绵羊红细胞 SRBC 免疫的小鼠脾脏细胞其抗体裂解红细胞后释放的血红蛋白量 OD值 比对照大。 2