植物组织培养第十章.pptVIP

Vir区：是T－DNA以外涉及诱发肿瘤的区域，在Ti质粒的物理图上位于T－DNA左侧，长30－40Kb，Vir区并不整合入植物基因，但却是T－DNA转移所必需。 T－DNA边界序列：T－DNA长约23Kb，但在其两端边界各有一个25bp的正向重复序列，高度保守，一般认为右端重复序列对T－DNA转移起重要作用。 农杆菌转化植物细胞的机理： （1）农杆菌对植物伤口的附着； 植物伤口释放出信号分子。如乙酰丁香酮（AS）以及羟基乙酰丁香酮（OHAS）等。 （2）Vir区基因表达的诱导； VirA以及VirG基因在酚类物质的诱导下得到表达。 （3）T－DNA中间体和T－链蛋白复合体的形成； VirD1和VirD2蛋白表达与T－DNA边界重复序列结合解缠绕与切割，VirC1和VirC2参与下，形成T－DNA转移中间体。并以DNA－蛋白质复合体形式存在和转移。VirE1和VirE2参与该过程。 （4）T－链蛋白复合体转移至植物细胞； T－链蛋白复合体（T－链、VirD2、VirE2）在VirB基因表达产物作用下，穿越细胞膜，VirB操纵子具有11个基因，产物定位于细胞膜上并形成一种膜结合T－复合体运输器，其中VirD2和VirE2蛋白分别具有导航和核定位作用。VirD2、VirE2以及VirF蛋白进入植物细胞。 （5）T－DNA拷贝与植物基因组的整合。 T－链蛋白复合体转移到细胞后，通过核膜上的小孔进入细胞核，与核DNA整合。整合机制尚不清楚。 Agrobacteria attach to plant cell surfaces at wound sites. The plant releases wound signal compounds, such as acetosyringone. The signal binds to virA on the Agrobacterium membrane. VirA with signal bound activates virG. Activated virG turns on other vir genes, including vir D and E. vir D cuts at a specific site in the Ti plasmid (tumor-inducing), the left border. The left border and a similar sequence, the right border, delineate the T-DNA, the DNA that will be transferred from the bacterium to the plant cell Single stranded T-DNA is bound by vir E product as the DNA unwinds from the vir D cut site. Binding and unwinding stop at the right border. The T-DNA is transferred to the plant cell, where it integrates in nuclear DNA. T-DNA codes for proteins that produce hormones and opines. Hormones encourage growth of the transformed plant tissue. Opines feed bacteria a carbon and nitrogen source. 农杆菌Ti质粒载体系统： 组成重组质粒，含有边界序列，能够在大肠杆菌和农杆菌中穿梭；含有完整的Vir基因。 （1）共整合载体系统：Ti质粒上编码致瘤基因的序列被一段pBR322DNA所取代，带有外源基因的pBR322衍生中间载体由大肠杆菌转入农杆菌后，发生同源重组，外源基因整合到Ti质粒上。 （2）二元载体系统：一个农杆菌株系中含有两个彼此分离的质粒，一个含有T－DNA和外源重组基因的多功能克隆载体质粒。既能在农杆菌中复制，并能够从大肠杆菌迁移到农杆菌，另一个质粒含有Vir基因的Ti衍生质粒。 （2）Ri质粒： 一种能够诱导植物细胞产生毛发状根的土壤杆菌（Agrobacterium rhizogenes），具有Ri质粒，能够将外源基因转入植物细胞中。 其T－DNA包括TL－DNA和TR－DNA和中间大约15Kb的核心DNA，在TR－DNA上具有两个非常重要的基因，tms1和tms2，指导IAA合成，TR－DNA上还有编码农杆碱合成和甘露碱合成的基因。 * * 第十