第五章第三节四层析.pptVIP

（1）层析柱 层析柱是下端有细口并带有筛板的玻管。柱的直径与长度之比，一般为1∶10- 1∶40。采用极细吸附剂装柱时，宜用比例大的层析柱。反之，则宜用比例小的层析柱。这样有利于节省时间和提高分辨率。层析柱的床体积是由吸附剂的量和膨胀度决定的。 （2）吸附剂的用量 吸附剂的用量是根据其自身的操作容量和分离物中各成分的性质决定的。当操作容量高时， 吸附剂用量少。一般吸附剂的用量为被分离样品的30-50倍。若样品中各成分的性质相似难以分开时，则吸附剂用量应增大，有时大于样品的100倍 （3）装柱 装柱的方法分干装法和湿装法两种。湿装法系先加适量平衡液到柱内，排走其中的空气，然后把预先用平衡液浸泡好的吸附剂搅匀，随即将此悬浮液连续倾入柱中，待其自然沉降至柱高的1/4-1/3时打开柱下端口，让溶剂慢慢流出，使柱上端悬浮液徐徐下降至需要的高度。 这种装柱法对各种基质都适用。层析柱中基质应合乎填装均匀、松紧一致和没有气泡的标准。 （4）上样和洗脱 上样：用滴管轻轻地把样品溶液加到固定相表面，要尽量避免冲动基质。加入样品液的体积一般应小于床体积的1/2。 洗脱：待样品液的液面流到固定相表面时，用滴管加入洗脱剂，并在柱上端与装有洗脱剂的贮液瓶连接开始冼脱。同时在柱下端与部分收集器接通，立即进行分级收集(按体积或时间分管收集)。 理想的洗脱曲线如图3-1所示。图中的A峰和B峰均呈对称形，二者没有重叠，这表明样品液中的组分已完全分开。层析峰的面积(FEG)、峰高(BE)和半峰高宽度(HI)等参数是定性、定量洗脱物的依据。 为了获得满意的分离结果，洗脱液的流速务必恰当控制。如果太快，洗脱物在两相中的平衡过程不完全；如果太慢，洗脱物会扩散。若峰与峰之间有重叠，宜降低洗脱剂的离子强度，若峰间距离过大，或某些成分不能洗脱时，宜加大洗脱剂的强度(极性)，成分复杂时，可采用洗脱剂由弱到强的梯度洗脱(方法见离子交换层析)。 由层析柱分离出的样品经浓缩或冻干处理后，可进行纯度测定。如杂质含量仍大时，应该用其它方法继续纯化。 （5）、注意事项 流速太慢，前峰拖尾与后峰相连 流速太快，组分分不开 正常的流速使组分完全分离 四、层析 （一）、层析的由来与发展 1901年，俄国植物学家茨维特将植物色素提取液加到装有碳酸钙微粒的玻璃柱子上部，继而以石油醚淋洗柱子，结果使不同的色素在柱中得到分离而形成不同颜色的谱带。混合色素通过碳酸钙微粒被分离成不同色带的现象，像一束光线通过棱镜时被分离成不同色带的光谱现象一样。 1906年在一篇论文中将这种方法正式命名为色谱法，色谱法由此得名。 1931Kuhn, Lederer用氧化铝和碳酸钙分离α-、β-和δ-胡萝卜素。使色谱法开始为人们所重视。 1938Izmailov, Shraiber最先使用薄层色谱法。 1938Taylor, Uray用离子交换色谱法分离了锂和钾的同位素。 1941Martin, Synge提出色谱塔板理论；发明液-液分配色谱；预言了气体可作为流动相（即气相色谱）。 1944Consden等发明了纸色谱。 1949Macllean在氧化铝中加入淀粉黏合剂制作薄层板使薄层色谱进入实用阶段。 1952Martin, James从理论和实践方面完善了气-液分配色谱法。 1956Van Deemter等提出色谱速率理论，并应用于气相色谱。 1957?基于离子交换色谱的氨基酸分析专用仪器问世。 1958Golay发明毛细管柱气相色谱。 1、原理 色谱法(Chromatography），也称色层法或层析法(后文中我们称之为层析法）。此种方法基于混合液中各组分的分子极性、分子大小与形状、吸附力、亲和力等物理化学性质的差异，导致各组分在流动相和固定相之间的分配系数不同，组分在两相间进行连续多次分配，从而彼此分离。 层析不只是分离技术，也是一种分析方法。 层析分离法基本原理 * 在色谱操作中，加入洗脱剂而使各组分分层的操作称为展开（Development）， 洗脱时从柱中流出的溶液称为洗脱液（Eluate）， 而展开后各组分的分布情况称为色谱（Chromatography）。 2、层析方法的共同特点： 层析分离体系都有流动相和固定相两个相。 层析过程中，流动相对固定相作连续的相对运动。 被分离样品在两相中具有不同的作用力，各组分混合物在流动相的带动下通过固定相，实现分离。 层析分离方法 层析方法 分离依据 吸附层析 利用吸附剂对不同物质的吸附力不同而使混合物中各组分分离 分配层析 利用各组分在两相中的分配系数不同，而使各组分分离 离子交换层析 利用离子交换剂上的可解离基团（活性基