荧光实验二同步荧光法同时测定色氨酸酪氨酸和苯丙氨酸2.doc

实验二 用同步荧光法同时测定色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸 一、实验目的 1. 了解等波长差同步扫描技术。 2. 学习用不同荧光法测定多组分混合物的方法。 二、实验原理 色氨酸 Try 、酪氨酸（Tyr）和苯丙氨酸 Phe 是天然氨基酸中仅有的能发射荧光的组分，可以用荧光法测定。但由于三者的激发光谱和发射光谱互相重叠，常规荧光法不能实现混合物中这三种组分的分别测定。同步扫描荧光光谱技术具有简化、窄化光谱、提高选择性等优点。等波长差 △λ λem－λex 同步扫描技术可以通过△λ的选择，实现多组分混合物的选择性测定。研究表明，当仅有酪氨酸和色氨酸共存时，分别利用酪氨酸 △λ＜15nm和色氨酸（△λ＞60nm）特征的同步扫描光谱可以实现这两组分的分别测定。当同时含有这三种氨基酸时，可以在pH7.4的缓冲介质中，以△λ 55nm进行同步扫描，利用苯丙氨酸217nm，酪氨酸232nm和色氨酸284nm的同步荧光峰进行分别测定。测定范围是苯丙氨酸：0.07～5mg/m；酪氨酸0.02～1mg/m；色氨酸0.001～0.5mg/m。酪氨酸在268nm处的同步荧光峰对色氨酸的测定有一定干扰，但可以校正。 三、仪器与试剂 1. 仪器 F-4500型荧光光度计，25m带玻璃塞的比色管，吸量管 2. 试剂 1 色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸标准溶液：先配制0.5mg/m标准溶液，再逐级稀释配制含色氨酸1g/mL；含酪氨酸2g/mL和含苯丙氨酸10g/mL的工作溶液。 2 pH7.4的 KH2PO4－NaOH缓冲液：0.5mol·L－1NaOH溶液与0.5mol·L－1KH2PO4按4:5体积混合而成。 四、操作步骤 1. 荧光激发、发射光谱测定 分别移取苯丙氨酸（4.0m）、酪氨酸 8m 和色氨酸（4.0m）标准溶液于25mL比色管中，各加入2m pH 7.4的KH2PO4－NaOH缓冲液，用水稀释至刻度摇匀，测定其荧光激发、发射和同步（△λ 55nm）光谱。确定其峰值波长和强度。 2. 荧光激发、发射光谱测定移取4.0m苯丙氨酸8mL酪氨酸和4.0m色氨酸标准溶液于一只25m比色管中，加入2m pH 7.4的KH2PO4－NaOH缓冲液，用水稀释至刻度摇匀，测定其荧光激发、发射和同步（△λ 55nm）光谱。确定其峰值波长和强度。波长差△λ的确定： 移取4.0m苯丙氨酸8mL酪氨酸和4.0m色氨酸标准溶液于一只25m比色管中，加入2mpH 7.4的KH2PO4－NaOH缓冲液，用水稀释至刻度摇匀，测定其同步（△λ 40、50、60、70nm，λex＝210）光谱。并记录扫描结果。其中苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸分别对应217nm，232nm和284nm的同步荧光峰强度。 注意： △λ的选择直接影同步荧光峰的峰形、峰位和强度，实验中应保持一致。 五、数据处理 1. 从激发和发射光谱中找出最大激发波长和最大发射波长值，以及它们相对应的峰高。 2．在它们的同步荧光光谱中也确定最大波长和对应的峰高。 六、思考题 1. 同步扫描荧光技术有哪些优点？ 2. 观察激发波长的整数倍处荧光发射光谱在有何特点？该波长是否适合于进行定量分析？ 3.通过两种氨基酸的化学结构，是否可以不经试验判断其荧光强度的大小次序。 苯丙氨酸 色氨酸 4.比较紫外分光光度法和荧光分析法的区别和各自的优缺点。