薄层色谱中应注意的问题.doc

薄层色谱中应注意的问题 黑龙江省药品检验所 李玥瑛 前言 平面色谱法是色谱分析法中的一个分支，主要包括纸色谱法和薄层色谱法。60年代后薄层色谱法的发展和普及使得纸色谱法的应用逐渐减少。80年代后出现了仪器化薄层色谱法或现代化薄层色谱法，即在高效薄层板上进行组合分离，并在薄层色谱的每一步骤均用一整套仪器代替以往的手工操作，可得到高质量的色谱图，再配以高质量的薄层扫描仪和数码成像系统。这样就使定性和定量的薄层色谱法在定量结果的重现性及准确度上大大提高。成为一种极有实用价值的分离分析方法。 理想的色谱分离及准确的定量结果，色谱条件标准化，操作技术规范化。 实验室分离提取 薄层色谱鉴别样品瓶 薄层鉴别点样 薄层色谱测含量的工作室 Linomat5型半自动点样仪 AMD2型全自动展开仪 衍生化（浸板）仪 加热烘箱 薄层色谱扫描仪 薄层数码成像系统 CAMAG铺板器 主要问题如下： 薄层板 点样 展开、展开室 展开剂 显色 含量测定 薄层扫描仪 一、薄层板 手工制板具体过程如下： 配制0.35％CMC_Na（羧甲基纤维素钠）水溶液 选择硅胶（固定相） 研匀过程（混合过程） 涂布 薄层板活化 薄层板预处理 检查使用 二、点样 点样前检查完薄层板后，决定用点状点样（鉴别、检查）还是条带状点样（含量测定）。点样后必须将溶剂全部除去后再进行展开，但要避免高温加热，以免改变待测成分的性质。点样量过多会造成原点“超载”，展开剂产生“绕行”现象使斑点拖尾或重叠，使扫描峰形不对称或不能基线分离，并由于超载导致非线型的校正曲线，严重影响定量结果，降低准确度。 工作时的点样位置 三、展开、展开室 相对湿度 展开室预饱和 温度 展开室的放置 展距 控制相对湿度硫酸配制表 五、显色 喷雾显色 浸渍显色 使用CAMAG的浸板器，需要设定浸板器抽出的速度和规定在显色剂中停留的时间。采用这种方法显色，由于浸渍条件可以精确地标准化，并且薄层各部位可以均匀地接触显色剂，，因此对改善定量时的重现性极为有利，此外对环境保护也优于喷雾法，故常采用。浸完的板，要立刻小心擦干背面玻璃上残留的溶液后平放于通风橱中晾干后再加热。 含量测定 外标一点法 当工作曲线是通过原点的直线时，选用一种浓度的标准品为外表一点法。 外标两点法 当工作曲线不通过原点时，选用高低两种浓度的对照品溶液点在薄层上为外标两点法。 两种方法的校正不仅可以对一个对照品斑点，还可以对多个同样量的对照品斑点的测得值进行平均后计算。 薄层扫描定量测定应保证供试品斑点的量在线性范围内，必要时可适当调整供试品溶液的点样量，不可以调整对照品溶液的点样量。 供试品与对照品同板点样、展开、扫描测定和计算。供试品点样不得少于两个，对照品每一浓度不得少于两个。沿展开方向扫描，不得横向扫描。 Rf在0.2～0.8范围内比较合适。Rf值太大，斑点扩散，峰形变宽，扫描重现性差；Rf值太小，则斑点没有完全展开，峰形太窄，扫描结果不能代表真实浓度。 汞灯中的特征谱线 313nm、365nm、435nm、546nm、578nm. 外标两点法公式： M：为样品板载含量 供试品浓度*供试品点样量 m1：为低浓度对照品板载含量 对照品低浓度*对照品点样量 m2：为高浓度对照品板载含量 对照品高浓度*对照品点样量 A1：为低浓度对照品峰面积均值 A2：为高浓度对照品峰面积均值 A：为供试品峰面积均值 薄层扫描仪 双波长、单波长 直线扫描、锯齿扫描 双波长扫描时采用两种波长的光束，先后扫描所要测定的斑点，并记录下两波长吸光度之差。两种波长的选择需对欲测斑点进行厚位光谱扫描，根据斑点的吸收光谱，选择最大吸收峰波长作为样品的测定波长λs；选择斑点吸收光谱的基线部分，即该化合物无吸收处的波长作为样品的参比波长λR。 用双波长扫描，由于在λs扫描所得测定值中减去了λR扫描测定值（斑点所在处的空白薄层设定值），薄层背景不均匀性得到了补偿，扫描曲线的基线较为平稳，测定精度得到改善。 其它 展开缸应相对应。10*20的板就用10*20的展开缸，方便移动且效果较好 展开缸盖不宜凡士林，应为毛玻璃盖密封加重物 预饱和，双槽，一边放展开剂，一边放板子，平衡后，展开剂倾倒，有板的一边不好，而将板放入展开剂中。 点样的位置，干燥后再展开。 展开缸盖滑动开关。 防止边缘效应，板子未点样端放入展开剂中后迅速拿出再放入。 选择展开剂各组分之间的极性不要差别过大；展开剂要用毒性小的纯度好的。 鉴别样溶解后，放入安瓿瓶中而不要放在蒸发皿中。 预饱和缸、板，平衡多久，自己优化。 扫描速度，光斑、宽度、定值（复验）。 点样吹风，不可热风，尽量不吹。 linomat5点样，按ENTER每次预排0.2μl而非▲▼，等距螺旋。 鉴别分不清斑点，可在样中加标再点一点。 样品的粘度要低，否