植物多靶点CRISPR-Cas9载体使用方法(2015-5-1)教程方案教程方案.docVIP

PAGE \* MERGEFORMAT 5 CRISPR/Cas9-based genome editing technology A robust CRISPR/Cas9 vector system for multiplex targeting of genomic sites in monocot and dicot plants 亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室 华南农业大学生命科学学院 刘耀光课题组 (ygliu@) pYLCRISPR/Cas9多靶点载体介绍 CRISPR/Cas9是新近发展的基因组编辑技术（图1）。CRISPR/Cas9切割靶序列仅需要single-guide RNA (sgRNA)以及由sgRNA引导的Cas9蛋白，比锌指核酸酶（ZFNs），TALENs更加简便，高效，因而成为基因组编辑工具的首选。 我们利用CRISPR/Cas9技术可方便地进行多重靶向的特征，构建了一套用于单子叶和双子叶植物的多靶点CRISPR/Cas9基因打靶载体系统。 本套载体将Cas9蛋白表达盒整合到双元载体上，用于装载多个sgRNA表达盒的多克隆位点Bsa I位于靠近双元载体RB位置。sgRNA表达盒元件设在中间质粒载体上，利用酶切连接和PCR方法拼装好，再利用Golden Gate或Gibson Assembly克隆方法组装到双元载体上。本载体系统已经发表（Ma et al., 2015, Molecular Plant, DOI:10.1016/j.molp.2015.04.007）。 Figure 1. A working model of the CRISPR/Cas9 system. The Cas9-sgRNA complex locates to the target site to cleave the DNA to produce double strand break (DSB). 2．CRISPR/Cas9载体与sgRNA载体图谱 2.1CRISPR/Cas9双元载体 本套载体系统的双元载体骨架为pCAMBIA-1300 (ACCESSION: AF234296)，Cas9p为本实验室设计合成的植物优化密码子基因，它模拟了禾本科植物基因具有5’端GC含量较高的特征 (Figure 2)。 这些质粒在E. coli TOP10F’(LacIq) 菌株繁殖，该菌株LacIq基因型产生的阻碍蛋白可抑制ccdB大肠杆菌致死基因的表达。 我们对pYLCRISPR/Cas9载体采用了新的命名，与旧的命名对应关系见表1。 pYLCRISPR/Cas9Pubi-H, -B载体中的Cas9p用PUbi驱动，优选用于单子叶植物的基因打靶；对于双子叶植物，我们前期使用pYLCRISPR/Cas9P35S-H在拟南芥获得了uniform简单突变（双等位突变，杂合突变，纯合突变）以及嵌合突变（Ma et al., 2015）。但是，我们最近发现用pYLCRISPR/Cas9Pubi-H在拟南芥的打靶效果效率比使用pYLCRISPR/Cas9P35S-H的效果效率更高，能得到更多的简单突变。因此也推荐在双子叶植物优先使用PUbi驱动Cas9p的载体pYLCRISPR/Cas9P35S-H或pYLCRISPR/Cas9P35S-B。 Figure 2. A CRISPR/Cas9 system for monocot and dicot plants. pYLCRISPR/Cas9Pubi-H, -B (above); pYLCRISPR/Cas9P35S-H, -N,-B (below); HPT (-H), Bar (-B), and NPT II (-N) encode hygromycin B phosphotransferase, PPT acetyltransferase and neomycin phosphotransferase II, respectively. NLS, nuclear localization sequence. The key sequences including restriction sites for cloning and analysis of sgRNA expression cassettes are given. Two Bsa I-cutting sties [Bsa I (B-L) and Bsa I (B-R)] for cloning the sgRNA expression cassettes are separated by a shorten form of the ccdB negative selection gene. 表一