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氨基酸螯合铁对血红素合成的影响 作者： 摘自：中国饲料添加剂信息网 日期：2005-06-13 摘 要 本试验利用体外酶学试验法研究了氨基酸螯合铁对ALA合成酶活力的影响。试验结果表明：① 当酶反应体系中血红素浓度为5×10-5mol/L时，对ALA合成酶有抑制作用。② 不同铁源对ALA合成酶的活性有促进作用，而且不同铁源对ALA合成酶活性的影响程度不同，甘氨酸和硫酸亚铁混合物组 硫酸亚铁组 赖氨酸和硫酸亚铁混合物组 赖氨酸螯合铁组 甘氨酸螯合铁组。 关键词 血红素，硫酸亚铁，赖氨酸螯合铁，甘氨酸螯合铁，合成 对血红素代谢的研究表明，ALA（δ-氨基-γ-酮戊酸，δ-Aminolaevulinic acid）合成酶是血红素合成酶系中的限速酶（顾天爵 1988）。研究表明血红素对此酶有反馈抑制作用。在一般情况下，血红素合成后，迅速与珠蛋白结合形成血红蛋白，不致有过多的血红素堆积，对ALA合成酶不引起反馈抑制。如果血红素的合成速度大于珠蛋白的合成速度，过多的血红素可氧化成高铁血红素。研究表明，当亚铁血红素的浓度为10-6mol/L时可抑制ALA合成酶的合成，为10-5~-4mol/L时可抑制ALA合成酶的活性（血红素的生理正常值为10-7~-6mol/L），而高铁血红素则是ALA合成酶的强烈抑制剂。 由于ALA合成酶受血红素含量（终产物的浓度）的调控，故根据生物化学的反馈抑制理论，提出一个假说：细胞内若有氨基酸螯合物铁存在，螯合物的结构与血红素相似，作为竞争性类似物，可能与ALA合成酶的控制中心结合，竞争结合调控位点，而这种结合只能是“类似”的，这种类似性不影响酶活力的变化，从而使ALA合成酶能在“较多”血红素存在时，仍有活性。 基于以上理论和前几个试验的结果，设计了本试验，拟通过体外酶学试验，研究氨基酸螯合铁对ALA合成酶活力的影响，推测氨基酸螯合铁对血红素合成的影响，为上述假说提供论据。 1 试验用试剂和仪器 ATP、磷酸吡哆醛、还原型谷胱甘肽、ALA标准物和血红素由Sigma公司购入。琥珀酰-CoA合成酶（25℃时，10U/mg）由德国Boehringer Mannheim公司购入。 蔗糖、EDTA、Tris、甘氨酸、琥珀酸、MgCl2、三氯乙酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、对－二甲氨基苯甲醛、冰醋酸、过氯酸、二氯化汞、浓盐酸、乙酰乙酸乙酯、冰醋酸、正丁醇、无水硫酸钠等均为国产，产品等级为分析纯试剂。 甘氨酸螯合铁、赖氨酸螯合铁为试验室制备品。 玻璃匀浆器、HZS-H恒温水浴振荡箱、日本日立 SCR20BC 20000RPM冷冻离心机、日本岛津UV-2401PC型紫外分光光度计。 2 试验实施的技术路线 2.1 线粒体的分离制备 匀浆介质：称取85.55g蔗糖、0.01gEDTA、6.05gTris，溶于约800ml蒸馏水中，加入4.25ml 0.1mol/L HCl，最后用蒸馏水定容至1000ml，于0℃冰箱中保存，备用。 具体操作：取新鲜猪肝脏，用预冷（0℃）的匀浆介质洗净，再用滤纸吸干表面水分，称重。将肝用剪刀剪碎，按每克肝脏组织加8ml匀浆介质，加入到玻璃匀浆器中，在冰浴中匀浆。待肝脏破碎后，移出到离心管中，在冷冻离心机上4 409×g离心15min，吸取上清液。上清液再在冷冻离心机上13 675×g离心30min，弃去上清液，余下的是线粒体部分。用匀浆介质洗涤四次，冻存。将来用时，经数次交替冻溶，使线粒体破碎，以此作为粗酶液。 2.2 反应条件的确定 主要方法参考Wider（1971）。取2ml反应液于试管中，2ml反应液组成如下：100μmol甘氨酸，100μmol琥珀酸，10μmol ATP，3.5μmol CoA，10μmol MgCl2，0.25μmol磷酸吡哆醛，10μmol还原型谷胱甘肽。50μmol Tris-HCl缓冲液（pH 7.2），1mg琥珀酰-CoA合成酶，精确数量的粗酶液。37℃保温30分钟，然后加入0.5ml 25%三氯乙酸，终止反应。取样分析ALA含量，如有ALA合成，说明上述反应条件适用，否则加以修改。 2.3 影响ALA合成酶的因素的确定（试验设计） 在2.2的基础上，按下列计划，加入可能影响ALA合成酶活性的物质，然后测定ALA的生成量，以研究ALA合成　　 酶活性的变化情况。 甘氨酸螯合铁、赖氨酸螯合铁、甘氨酸与硫酸亚铁的混合物、赖氨酸与硫酸亚铁的混合物、硫酸亚铁,以上为同一浓度；亚铁血红素，分别为高和低两个浓度。根据血红素的生理正常值和抑制ALA合成酶活性时的浓度，本试验设定高血红素浓度为5×10-5 mol/L，低血红素浓度为5×10-7mol/L；甘氨酸螯合铁、赖氨酸螯合铁、甘氨酸与硫酸亚铁的混合物、赖氨酸与硫酸亚铁的混合物、硫酸亚铁的浓度均设为5×10-5