细胞核的分离和鉴定.pptVIP

医学细胞生物学 设计型实验设计报告 实验项目： 细胞核的分离与鉴定 年级班级： 临床11级K-2班 小组成员 学号 杨冲冲 1120150224 梁明方 1120150225 莫安行 1120150227 胡 露 1120150229 赵 成 1120150231 申德辉 1120150232 医学细胞生物学设计型实验设计报告 实验项目： 细胞核的分离与鉴定 实验原理： 1、核体的制备核体是指含有少量细胞质并由质膜包裹的细胞核。分离细胞核的可用方法有吸出法、原生质体破裂法、差速离心法排和排除法。 差速离心法是根据细胞内各种细胞结构的比重和大小不同，因而在同一离心场内的沉降速率不同从而将细胞内的结构分级分离出来。本实验就采用差速离心法。 2、细胞核的鉴定，因为细胞核中主要含DNA，而DNA是碱性蛋白，因此将分离出来的核体经三氯醋酸处理后，屏风，抽提掉核酸后，用碱性固绿染色，可使细胞核内碱性蛋白呈现出来。 实验步骤： （1）小鼠的处死及取材： 断头处死小白鼠，迅速解开其腹腔取出肝脏，去出结缔组织，剪成小块，尽快置于盛有0.9%NaCl的烧杯中。反复洗涤尽量除去血污，用滤纸吸去表面的液体。 （2）匀浆机过滤：将湿重为1g的肝组织放入烧杯中，用量筒取8ml预冷的0.25mol/L蔗糖-0.003mol/L的CaCl2溶液，先加少量溶液于烧杯中，尽量剪碎肝组织后全部加入。将剪碎的肝组织导入匀浆管中，使匀浆器下端侵入盛有冰块的器血中，左手持，右手将匀浆捣杆垂直插入管中，上下转动研磨3-5次。用3层纱布过滤于匀浆管中，然后制备一张涂片①，自然干燥。 （3）平衡：将装有滤液的离心管配平后，放入普通离心机以2500r/min离心15min,弃去上清液。 （4）离心及涂片：用6ml 0.25mol/L蔗糖-0.003mol/L的CaCl2溶液悬浮沉淀物，以2500r/min离心15min 弃去上清液，将残留液体用气管吹成悬液，滴一滴于干净的载盖玻片上，制成涂片②，自然干燥。 （5）固定：将制备好的涂片放入70%的乙醇中固定5-10min,晾干。 （6）提取核酸：三氯醋酸处理，将已固定的涂片侵入90℃5%的三氯醋酸溶液中处理20min.取出用细水冲洗玻片上的三氯醋酸至冲尽，用滤纸吸玻片上多余的水分。 （7）染色：将制好的涂片放入0.1%的碱性固绿中染色10min,然后用细水冲洗，晾干。 （8）镜检。 预期结果： 1、在低、高倍镜下，可以观察到经.0.1%碱性固绿染色的小白鼠肝细胞的细胞核体被染成绿色。说明这是碱性蛋白，即细胞核已游离出来。 2、经碱性固绿染色的核体涂片被染成绿色，说明这是碱性蛋白，即细胞核。 注意事项： （1）显微镜的正确使用 （2）、用三氯醋酸处理时，时间不能过长或过短，过长会是核膜裂解，过短会使抽取的核酸不够。 （3）、在染色时时间一定要足够，否则染色不完全会得到不理想的结果。 （4）、去掉胞质的核体贴附能力弱，应注意在用固定、三氯醋酸处理、染色时尽量避免胞核的脱落。 （5）离心机使用时要注意安全，离心前一定要将离心管平衡，否则容易伤害到自己和他人。 教师： 日期： 实验仪器、设备、器具表实验项目： 动物细胞细胞核的分离与鉴定 名称 规格、型号 数量 说明 显微镜 1 镜检 普通离心机 1 离心 离心管 1 装离心液 滴管 玻璃漏斗 1 过滤 量筒 1 量取液体 烧杯 1 盛放肝组织 解剖剪 1 解剖及取材 镊子 1 玻璃匀浆器 1 载玻片/盖玻片 制作涂片 染色盘架 1 水浴箱 1 水浴 吸纸 纱布 实验试剂表实验项目： 动物细胞细胞核的分离与鉴定 谢谢！ * * 作为等渗溶液 0.9%NaCl 生理盐水 蒸馏水 5% 三氯醋酸 作为等渗溶