第五章酶分子修饰要点分析.ppt

Chapter 5 Directed Evolution and Modification of Enzyme Molecule 酶的分子修饰和定向进化 崔建东 博士 Cjd007cn@163.com Contents of chapter 5 酶分子修饰 酶作为生物催化剂，其高效性和专一性是其他催化剂所无法比拟的。因此，日益增多的酶制剂已用于食品发酵、疾病诊治和预防、环境保护和监测、化工产品的生产等领域。 为什么要对酶进行修饰??? 酶在实际应用中有局限性： 1、作为异体蛋白在体内难于吸收、易引起免疫反应和被识别降解； 2、酶蛋白经不起温度、酸碱、有机溶剂及时间的考验，半衰期短、易变性失活； 3、酶的活性、作用专一性和最适条件不一定能适应生产工艺要求，限制了酶制剂的应用范围。 酶的结构 酶的结构 酶活性中心（activity site) 酶分子中直接与底物结合，并催化底物发生化学反应的部位，称为酶的活性中心。它是由三级结构中空间位置相邻的几个氨基酸共同构成的。 酶的结构 酶活性中心（activity site) 酶的活性中心包括两个功能部位：一个是结合部位，是酶与底物结合的基团，决定酶的专一性；另一个是催化部位，催化底物敏感键发生化学变化的基团，决定酶的催化能力。但这两个部位并不是各自独立存在的，相互联系。 酶的结构 酶的结构 活性中心的重要化学基团 7种氨基酸出现的频率最高 Lys Asp Glu Cys His Tyr Ser 某些功能基团,如（氨基、羧基、巯基、羟基和咪唑基）是酶的必需基团。 酶的结构 活性中心的共性: 1、活性部位只占酶分子很小的一部分（1-2%）。 酶的结构 活性中心的共性: 2、活性部位是一个三维实体。 3、活性中心位于酶分子表面的疏水性裂缝中。 酶的结构 活性中心的共性: 4、活性中心构象不是固定不变的（诱导契合）。 酶的结构 活性中心的共性: 5、酶与底物通过盐键、氢键、范德华力和疏水作用等次级键结合。 酶的结构 Problem?? 既然活性中心如此重要，我们应该如何检测它呢？ 酶的结构 研究酶活性中心的方法 1.物理学方法： 用X射线衍射法直接检测底物或其类似物与酶形成的中间复合物（包括酶和底物）的相对位置。 酶的结构 研究酶活性中心的方法 1.物理学方法： X射线衍射原理：?X射线是一种波长很短的电磁波，能穿透一定厚度的物质，当一束 X射线通过晶体时将发生衍射，衍射波叠加的结果使射线的强度在某些方向上加强，在其他方向上减弱。分析在照相底片上得到的衍射花样，便可确定晶体结构。 酶的结构 酶的结构 研究酶活性中心的方法 2、化学修饰法 1)非专一性化学修饰 用非专一性的修饰试剂与氨基酸侧链基团相互作用。 Problem??? 怎样判断化学试剂是同活性中心内的必需基团结合？ 酶的结构 研究酶活性中心的方法 2、化学修饰法 1)非专一性化学修饰 某基团被修饰后,无非出现以下两种情况： 酶活性不变——该基团可能不是酶的必需基团。 酶活性降低或丧失——该基团可能是酶的必需基团。 酶的结构 研究酶活性中心的方法 2、化学修饰法 1)非专一性化学修饰 活性中心基团的鉴定标准 ①失活程度与修饰剂浓度成一定比例关系。 ②S或可逆抑制剂有保护作用（活性中心）。 先加S 加共价修饰剂 透析除去S 活性不丧失 酶的结构 研究酶活性中心的方法 2、化学修饰法 2)专一性化学修饰 （1）基团专一性修饰 用专一性化学修饰剂修饰酶活性中心的某一氨基酸残基的侧链基团。 酶的结构 研究酶活性中心的方法 2、化学修饰法 2)专一性化学修饰 （2）位点专一性修饰（亲和标记） 采用的修饰试剂是根据底物的化学结构设计合成的含有活泼反应基团的底物类似物。 作用机制：利用酶对底物的特殊亲和力将酶加以修饰标记。 酶的结构 研究酶活性中心的方法 2、化学修饰法 2)专一性化学修饰 （2）位点专一性修饰（亲和标记） 含有活泼反应基团的底物类似物： ①与S结构相似，与活性中心的氨基酸残基亲和力大，而与活性中心以外的氨基酸残基亲和力小。 ②具有活泼的化学基团（如卤素）可与活性中心的基团形成稳定的共价键。 酶的结构 3.蛋白质工程： 将酶相应的DNA定点突变，突变的DNA只表达一个或几个氨基酸被置换的酶蛋白，测定其活性可知被置换的氨基酸是否为活力所必需。 改变酶特性有两种主要的方法 1)通过分子修饰的方法来改变已分离出来的天然酶的活性。 2)通过基因工程方法改变编码酶分子的基因而达到改造酶的目的。 1 什么是酶分子修饰？ 通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的技术过程称为酶分子修饰。即：在体外将酶分子通过人工的方法与一些化学基团（物