CRISPR_Ca9介导的基因组定点编辑技术_方锐.docxVIP

ReviewsandMonographs综述与专论生物化学与生物物理进展ProgressinBiochemistryandBiophysics2013, 40(8):691~702CRISPR/Cas9 介导的基因组定点编辑技术*方锐畅飞孙照霖李宁孟庆勇**(中国农业大学农业生物技术国家重点，北京100193)摘要Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas)9 系统成功被改造为第三代人工核酸内切酶，与锌指核酸内切酶(zinc finger endonuclease，ZFN)和类转录激活因子效应物核酸酶(transcription activator-like effector nuclease，TALEN)一样可用于各种复杂基因组的编辑．目前该技术成功应用于人类细胞、斑马鱼和小鼠以及细菌的基因组精确修饰，修饰类型包括基因定点InDel 突变、基因定点敲入、两位点同时突变和小片段的缺失．由于其突变效率高、制作简单及成本低的特点，被认为是一种具有广阔应用前景的基因组定点改造分子工具．本文从CRISPR/Cas 的研究历史、分类、作用机理以及基因定点修饰应用等方面进行简单介绍，希望能够为在这一领域的科研工作者提供参考．关键词人工核酸内切酶，基因编辑，CRISPR，基因打靶，CRISPR/Cas学科分类号Q7DOI:10.3724/SP.J.1206.2013.00215基因定点修饰是研究基因功能的重要手段之一，也可被用于人类遗传性疾病的治疗，因此这类技术成为现代分子生物学的研究热点．早期仅基于同源重组的基因打靶技术效率极低，应用受到限制．直到人工核酸内切酶(engineered endonuclease，EEN)出现，将这一现状彻底改变．锌指核酸内切酶(zincfingerendonuclease，ZFN)是第一代人工核酸内切酶．锌指是一类能够结合DNA 的蛋白质，人类细胞的转录因子中大约有一半含有锌指结构，ZFN 是将锌指蛋白与核酸内切酶FokⅠ融合形成的核酸内切酶[1]，利用它可以在各种复杂基因组的特定位置制造DNA 的双链切口．到目前为止，ZFN 已经成功应用于黑长尾猴、大鼠、小鼠、中国仓鼠、斑马鱼、果蝇、海胆、家蚕、拟南芥、烟草、玉米、猪、牛、人类iPS 细胞[2]．更令人振奋的是已经有用于治疗HIV 的ZFN(破坏人CCR 基因表达)药物进入二期临床试验[3]．但是，ZFN 制备复杂，成本昂贵，而且其技术专利被少数几家商业公司控制．很快，第二代人工核酸酶—类转录激活因子效应物核酸酶(transcriptionactivator-likeeffectornuclease，TALEN) 的出现在很大程度上替代了ZFN．2009 年，科学家将一种水稻的致病菌(Xanthamonas)编码的类转录激活因子效应物(transcription activator-like effector，TALE)与DNA 的碱基对应关系解密[4-6]．2010 年，首次报道TALEN 蛋白在酵母中应用成功[7]，之后，在植物、人类细胞、小鼠、斑马鱼、猪、牛中得到迅速的应用[8]．TALEN 可以和ZFN 一样对复杂的基因组进行精细的修饰，同时其构建较为简单，特异性更高，因此受到了科研工作者的青睐．2012 年，TALEN 被《科学》(Science)杂志评为十大科学突破之一[9]．无论是ZFN还是TALEN，这两种人工核酸酶的原理是一样的，都是由DNA 结合蛋白与核酸内切酶FokⅠ融合而成．2013年初，一种全新的人工核酸内切酶clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/ CRISPR-associated(Cas)9出现，它主要是基于细菌的一种获得性免疫系统改造而成，其特点是制作简单、成本低、作用高效[10]．本文主要从CRISPR 研究历史、作用机理以及CRISPR/Cas 在定点修饰中的应用等方面介绍CRISPR/Cas9 的研究进展．*现代农业产业技术体系建设专项资助项目(CARS-37).**通讯联系人.Tel: 010 E-mail:qingyong.meng@收稿日期：2013-05-19，接受日期：2013-07-29CRISPR/Cas 的基因座结构CRISPR/Cas 的基因座结构相对简单(图1)．以产脓链球菌(Streptococcus pyogenes SF370)的典型TypeⅡCRISPR/Cas 为例，其基因座结构可分别三部分，5端为tracrRNA基因，中间为一系列Cas