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3株乳酸菌体外拮抗致病性大肠杆菌试验 （哈尔滨中科生物工程有限公司 赵前） 摘要: 为研究乳酸菌体外对大肠杆菌的拮抗作用, 将3 株乳酸菌与2株大肠杆菌体外分别共培养观察拮抗情况。结果显示, 等量同时间接种, 96h内乳杆菌就将大肠杆菌全部抑杀; 乳酸菌比大肠杆菌早24 h 接种, 72 h内将大肠杆菌全部抑杀; 大肠杆菌比乳酸菌早24 h 接种, 在120 h 内也可全部被抑杀。3 株乳酸菌按一定比例复合, 会使拮抗的效果增强。 关键词: 微生态、中药、益生素、发酵、乳酸杆菌; 大肠杆菌; 拮抗作用 畜禽大肠杆菌病是畜牧业生产中常见传染病之一, 对集约化养殖业危害极大。生产上由于大肠杆菌耐药情况非常严重,给临床治疗此病带来困难 。乳酸杆菌是畜禽肠道内主要的正常菌群, 具有抗感染、免疫刺激等许多生理功能。本试验研究3株乳酸菌体外对大肠杆菌的拮抗作用, 以期为乳酸菌用于预防治疗大肠杆菌病提供理论依据。 1 材料与方法 1.1 试验材料 菌种: 乳酸乳杆菌( Lactobacillus lactis, L.l)、嗜酸乳杆菌( Lactobacillus acidophilus, L.a )、乳酸链球菌( Strep toccuelactis, S.l) 分离自健康鸡肠道; 大肠杆菌1701株由发病鸡场分离得到; 大肠杆菌TM 128株由江苏省农业科学院惠赠。 培养基: 改良MRS液体培养基、普通琼脂培养基、普通肉汤培养基。 1.2 试验方法 将乳酸乳杆菌、乳酸链球菌、嗜酸乳杆菌、大肠杆菌分别在各自适宜的培养基内繁殖, 传1代。取20 h培养物, 调整菌的浓度为10^7 CFU /mL。 取含改良MRS液体培养基试管4 支, 分别接种乳酸乳杆菌、嗜酸乳杆菌、乳酸链球菌及三者的混合物( 50:50 :2) 100uL, 同时再分别接种大肠杆菌1701或TM 128各100 uL; 设大肠杆菌单独培养管作对照, 置恒温培养箱37 培养。取培养24、48、72、96、120 h的培养液倒普通琼脂平板, 检查大肠杆菌存活情况, 记录含活菌数。 取含改良MRS液体培养基试管4 支, 分别接种乳酸乳杆菌、嗜酸乳杆菌、乳酸链球菌及三者的混合物( 50:50: 2) 100 uL, 37 培养24 h后, 分别接种大肠杆菌各100 uL, 置恒温培养箱37 再培养; 取培养24、48、72、96、120 h的培养液倒普通琼脂平板, 检查拮抗情况。 取含改良MRS液体培养基试管4支, 接种大肠杆菌各100 uL, 37 培养24 h后, 分别接种乳酸乳杆菌、嗜酸乳杆菌、乳酸链球菌及三者的混合物( 50:50:2) 100 uL, 37 ℃再培养; 取培养24、48、72、96、120 h的培养液倒普通琼脂平板,检查拮抗情况。 分别取上述各时间点培养物0.5 mL, 用灭菌生理盐水做连续稀释( 10^-1－ 10^-10 ) 后, 用滴注法点种于事先制作并烘 干表面水分的普通琼脂平板上, 每滴100 uL, 每个稀释度平 行3滴。经37℃ 24 h培养后分别计数大肠杆菌菌落数。 2 结果 ( 1) 乳酸菌和大肠杆菌同时接种, 乳酸菌对大肠杆菌的拮抗作用结果见图1和图2。 图1 同时接种乳酸菌对大肠杆菌1701拮抗结果 图2 同时接种乳酸菌对大肠杆菌TM 128拮抗结果 由图1、2可以看出, 无论是试验组还是对照组, 1701株与TM 128在前24 h都处于增殖期, 试验组在24 h后, 细菌数开始下降, 而对照组, 则在48 h后, 开始出现下降, 但是试验组明显下降的更快。乳酸菌和大肠杆菌培养96 h后, 大肠杆菌全部被抑杀, 对照组培养120 h后, 大肠杆菌仍有存活。复合菌表现出比单一菌更强的拮抗能力。 ( 2) 乳酸菌培养24 h 后接种大肠杆菌, 乳酸菌对大肠杆 菌的拮抗作用结果见图3和图4。 图3 乳酸菌培养24 h后接种大肠杆菌1701的拮抗结果 图4 乳酸菌培养24 h后接种大肠杆菌TM 128的拮抗结果 结果表明, 当乳酸菌先培养24 h, 然后接种大肠杆菌共培养时无论是试验组还是对照组在前24 h,大肠杆菌仍然处于增殖期, 但是试验组大肠杆菌的增殖幅度明显小于同时间等量接种结果, 说明了乳酸菌提前接种具有良好的拮抗效果。 ( 3) 大肠杆菌先培养24 h后, 再接种乳酸菌对大肠杆菌的拮抗作用见图5和图6. 图5 大肠杆菌1701培养24 h后接种乳酸菌的拮抗结果 图6 大肠杆菌TM 128培养24 h后接种乳酸菌的拮抗结果 图5、6