l绿色荧光蛋白要点.ppt

这张图片出自杰夫·利希曼(Jeff Lichtman)之手，展现了大脑内的连接，图片中美丽的“彩虹”就是神经系统网络。 thanks * * 美籍华裔科学家钱永健(左)从瑞典国王 卡尔十六世·古斯塔夫 手中领取诺贝尔奖证书和金质奖章 会发光的水母 绿色荧光蛋白在细胞生物学中的应用 主讲人：李婷 绿色荧光蛋白——照亮生命科学的一盏明灯 绿色荧光蛋白(GFP)是一种生物发光蛋白，其内源荧光基团在受到紫外光或蓝光激发时可高效发射清晰可见的绿光。由于其具有发光的特性。已成为在生物化学和细胞生物学中研究和开发应用得最广泛的蛋白质之一，因而在科研及生物医药等领域具有良好的应用前景。 由于GFP稳定、灵敏度高、无生物毒性、荧光反应不需要任何外源反应底物及表达无物种或细胞组织的专一性, 检测简单， 结果真实可靠，是一种独特的报告蛋白 。可广泛用于基因的表达与调控、蛋白质的定位、转移及相互作用、信号传递、转染与转化, 以及细胞的分离与纯化等研究领域。 GFP在细胞生物学研究中的应用 1. 对细胞生理过程的检测 2. 细胞筛选 3 .细胞亚结构及蛋白质分子的定位 4. 用于细胞内蛋白质的动力学研究 5. 计算细胞生长速度 6. 观察细胞内酶的活动 7. 用于细胞示踪实验研究 8. 基因表达调控 9. 定量分析 10. GFP报告蛋白用于细胞活体分离与纯化 1对细胞生理过程的监控 在过去的几年中，通过随机和人工诱变得到了许多不同颜色的GFP突变体。通过基因操作，许多蛋白都成功的与GFP进行了融合，通过这些融合蛋白就可以对相应蛋白的表达和转运及生理反应进行监控。目前GFP融合蛋白对细胞内迅速的生理反应的报告大概有三种方式：转移和定位、GFP光谱的生化修饰、荧光共振的能量转移(FRET)。 2 细胞筛选 基于GFP能够吸收、发射光，并且荧光稳定以及检测方法快速、方便的特性，GFP在细胞筛选上应用广泛。 Yuk等使用GFP 作为标记能快速筛选出在生长抑制环境下，仍能保持重组蛋白大量表达的CHO细胞。另外，研究发现通过GFP 荧光的减少，可以测量出鼠和人细胞的凋亡。因此，用流式细胞计数仪或荧光活化细胞计数仪( FACS) 很容易将两类细胞分离开来。 3 细胞亚结构及蛋白质分子的定位 对于许多蛋白质来说，易位是它们激活机制中的一部分。以前多是用细胞分级分离和免疫细胞化学的技术进行研究，而现在利用GFP融合蛋白的显像技术无疑是一种简便而可靠的检测方法，我们不仅可以更快地而且可以更全面地对蛋白质的移动进行研究。 4 用于细胞内蛋白质的动力学研究 研究细胞内蛋白质相互作用的技术主要有两种：光漂白荧光恢复法(FRAP)、光漂白荧光损失法(FLIP)。另外一种可以用来研究细胞内反应动力学的方法就是荧光相关性分光光镜检查(FCS)。这种方法是首先通过聚焦照射在细胞内形成一个一定大小的光洞，光洞中荧光探针的移动会引起荧光的波动，通过校正计算出荧光颗粒的平均滞留时间和平均数量，再根据已知光洞的大小和平均光滞留时间就可以计算出扩散蛋白的动力学参数。 5 计算细胞生长速度 在高水平组合型表达GFP 的细胞品系中, 在细胞生长的对数期, 绿色荧光蛋白所发出的荧光信号与细胞的数量密切相关。测量到的任何荧光强度都可以相应地转变成细胞浓度。利用这一技术, 可以测定某些细胞的分布和生长状况, 尤其是一些透明的动物和植物组织内特定细胞、化合物的生长、分布情况。也有人用此项技术进行病毒在植物体内的生长、扩散情况的研究, 取得了不错的效果。 6.观察细胞内酶的活动 GFP突变子不仅仅可以用来探测融合蛋白的空间定位，而且可以对活细胞的酶活动进行报告，还可以测量与酶活动相关的细胞内的pH、cAMP、Ca2+浓度。通过将外源序列插人GFP基因中，可以对细胞内酶的活动进行观察以及了解这些酶的生理学参数。插入外源基因后所表达的融合蛋白中的GFP蛋白发色基团会发生构像改变，其发射的荧光的强度也会发生很大的变化。这些指示剂可以用来检测细胞内许多酶的作用。 7 用于细胞示踪实验研究 利用GFP的荧光可以清楚地对肿瘤细胞的生长和转移进行追踪。体内肿瘤侵袭的研究要求在周围正常细胞背景下，能识别少量甚至是单个的瘤细胞。以往用抗肿瘤细胞特异性抗原、抗体进行免疫组化分析，操作较为复杂,且对抗原性有较高要求。利用β半乳糖昔酶(Lac Z)作为标记基因转染肿瘤细胞，操作较为复杂，且需底物分子。而用GFP就可以准确而简便地对肿瘤细胞进行示踪。 8.基因表达调控 Clontech 公司构建了一种叫启动子报告载体即是一个没有启动子的GFP质粒，专门用来测试各种启动子对GFP表达的效率，以及某些增强子对GFP表达的调控效果 。在高等植物遗传转化的基因表达调控研究中，已有很多报告蛋白被应用但