RT-PCR操作流程（promega).docVIP

RT-PCR操作流程 一、 RNA提取 1、 细胞培养所需数量后，吸出培养液，以5ml 无菌冰冻的PBS液清洗1次；吸出PBS液，以5ml无菌冰冻的DEPC处理的水清洗1次； 吸出DEPC水，直接向培养板中加入Trizol以裂解细胞，每10 cm2 面积加1 ml（5-10×106），使Trizol液旋转培养瓶充分覆盖细胞表面即可，用取样器抽打数次，充分裂解细胞。（对于难裂细胞可先用约1 ml 0.25%胰酶消化，以5ml 无菌冰冻的PBS液清洗1次，离心弃上清收集细胞；以5ml无菌冰冻的DEPC处理的水清洗1次，离心弃上清收集细胞，加入约1 ml Trizol用取样器抽打数次，充分裂解细胞。） 对于组织，无菌状态下取100mg组织（黄豆大小），以无菌冰冻的DEPC处理的水清洗1次，加1ml Trizol，用DEPC水及高压、烘干处理过的玻璃匀浆器在冰浴中将组织快速匀浆（1 min之内），肉眼不到组织细胞块。 2、 转移细胞裂解液到1.5 ml EP管中。将均浆样品在15-30℃ 放置5分钟，使得核酸蛋白复合物完全分离。（如有条件可先用均浆器均浆细胞裂解物15~30s。） 3、 每使用1 ml Trizol加入0.2 ml氯仿，盖好管盖，剧烈震荡15秒。 4、 4℃ 10，000×g 离心10分钟，取上层的水相转移至另一新EP管中。（切勿污染下层液体） 用乙醇和异丙醇连续沉淀分别分离下层有机相的DNA和蛋白。此步的样品先放置冰箱中，以准备提取DNA用。 5、 每使用1 ml Trizol加入0.5 ml 预冷的异丙醇（提前放置-20预冷），充分混匀，15-30℃放置10 分钟。 6、 4℃ 10，000×g 离心10分钟收集RNA沉淀，尽可能的弃上清。（此时应在管壁上观察到白色RNA沉淀）。 7、 加1 ml 75% 乙醇（DEPC水配制）洗涤沉淀，4℃ 10，000×g 离心10分钟收集RNA沉淀。以200 ul处理过的枪头尽量吸尽残存乙醇（注意要尽量吸除，又要防止损失RNA）。打开离心EP管，在实验台放置几分钟，挥发残存乙醇，不应干透。 8、 加入50ul 左右的DEPC处理的水，充分溶解RNA。放置于-80度保存。 9、 RNA质量的鉴定：取1-2ul RNA产物用1%琼脂糖凝胶电泳跑胶，应可以观察到三条带（28s,18s,5s），高质量的RNA提取物应28s（2kb）和18s(1kb-2kb)处可观察到明显的条带，RNA提取失败的标志是无带出现，或者带集中在1kb以下，提示RNA的完整性受到破坏，此时应放弃下续实验（注意：应尽量在新鲜制备的胶和电泳缓冲液中进行，并且电压应提高180v，以在10分钟内观察结果,防止因为电泳过程RNA降解影响质量判断）。RNA(OD280)的OD260/280比值应该应在1.8～2.0左右，比值过大提示DNA（OD260）污染严重，比值太小提示蛋白或酚污染。 DNA的分离。 准备物品：10％乙醇的0.1 Ｍ柠檬酸钠液。 ８mmol/L NaOH １、 在上述的第４步时，样品加入氯仿离心分层后，移去上层水相后，用乙醇沉淀中间层和有机相的DNA。每使用１ml Trizol加0.3 ml无水乙醇混均，室温放置３分钟，4℃不超过2000 ×g离心５分钟。 ２、 移去上清，用含10％乙醇的0.1 Ｍ柠檬酸钠洗涤DNA沉淀，每使用１ml Trizol加１ml 柠檬酸钠，室温放置３０分钟，4℃，2000 ×g离心５分钟，弃上清，重复一次。 ３、 用75%乙醇再洗涤DNA沉淀一次，每使用１ml Trizol，加1.5ml-2ml 75%乙醇。室温放置10-20分钟（不时颠倒混合），4℃，2000 ×g离心５分钟，弃上清。 ４、 室温放置凉干DNA　5-15分钟。用８mmol/LNaOH 溶解DNA。加入300-600ul NaOH溶解。 ５、 二、 RT 采用TakaRA RNA LA PCR Kit。 按下列量进行： M×MLV 5×RT buffer------------5ul (promega) dNTP----------------------------------1.25ul Rnase inhibitor-----------------------1.25ul (takara) M-MLT RT---------------------------1 ul (promega) Oligit-dt-------------------------------1ul (promega) RNA模板----------------------------15ul(根据电泳带的亮度，小于2ug) Rnase free H2O---------------------