第16章紫外-可见分光光度法总结.pptVIP

Visible Spectrophotometry and Ultraviolet Spectrophotometry 内容提要: 2.分光光度法的基本原理 ?透光率与吸光度 ?朗伯-比尔定律 3.紫外-可见分光光度法 ?分光光度计 ?定量分析方法 5.紫外分光光度法应用简介 ?752型分光光度计 ?紫外分光光度法的应用 图16-1三(邻二氮菲)合铁(II)离子的吸收光谱图 ?max=508nm 电子跃迁类型： 1.σ→ σ*跃迁： 饱和烃（甲烷，乙烷） E很高，λ150nm（远紫外区） 2. n → σ*跃迁： 含杂原子饱和基团（-OH，-NH2） E较大，λ150~250nm（真空紫外区） 3. π→ π*跃迁： 不饱和基团（-C＝C-，-C ＝ O ） E较小，λ~ 200nm 体系共轭，E更小，λ更大 4. n → π*跃迁： 含杂原子不饱和基团 （-C ≡N ，C＝ O ） E最小，λ 200~400nm（近紫外区） 按能量大小：σ→ σ* n → σ* π→ π* n→ π* 注： 紫外光谱电子跃迁类型 ： n —π*跃迁 π—π*跃迁 饱和化合物无紫外吸收 电子跃迁类型与分子结构及存在基团有密切联系 根据分子结构→推测可能产生的电子跃迁类型； 根据吸收谱带波长和电子跃迁类型 →推测分子中可能存在的基团（分子结构鉴定） 第二节 分光光度法基本原理 例 溶液中铁(Ⅱ)浓度为5.0×10-4 g·L-1的，与1,10-邻二氮杂菲反应，生成橙红色络合物，该络合物在波长508 nm，比色皿厚度为2cm时，测得A=0.190 。计算1,10-邻二氮杂菲亚铁的a及ε。(已知铁的相对原子质量为55.85) 解：根据比耳定律：A = a b c 例13-2：测试酶与腺苷酸(AMP)体系的吸光度如下：A(280nm) = 0.46， A(260nm) = 0.58，试计算每一组分的浓度。 已知：酶的?(280nm) = 2.96?104L?mol-1?cm-1 ?(260nm) = 1.52?104L?mol-1?cm-1 AMP的?(280nm) = 2.4?103L?mol-1?cm-1 ?(260nm) = 1.5?104L?mol-1?cm-1 吸收池厚度为1.00cm。 解：设酶和AMP的浓度分别为y和z： ?为260nm时： 0.58 = 1.52?104?1.00y + 1.5?104?1.00z ?为280nm时： 0.46 = 2.96?104?1.00y + 2.4?103?1.00z 解方程得：y = 1.4?10-5（mol?L–1） z = 2.5?10-5（mol?L-1） 即： 酶的浓度为1.4?10-5 mol?L–1， AMP的浓度为2.5?10-5 mol?L-1 。 第三节 可见分光光度法 一、分光光度计 (spectrophotomete ) 主要部件： 光源 ? 单色器 ? 检测器 ? 吸收池 ? 指示器 光 源：钨灯，发出320~3200nm的连续光谱。 单色器：以棱镜或光栅分光，提供单色光。 吸收池：分光光度计中用来盛放溶液的容器。 检测器：将通过吸收池的光转换为光电流，再经放大输入指示器，然后显示。 指示器：显示A或T 。 72型分光光度计结构图 二、定量分析方法 1、标准曲线法 取系列浓度标准溶液，测定吸光度A，作吸光度A对溶液浓度c的图，得过坐标原点的直线。 在相同条件下，测量被测溶液的吸光度，在标准曲线上查得溶液度。 2、标准对照法 预先配制一个与待测液浓度相接近的标准溶液(其浓度用cs表示)，测得其吸光度为As，再测定待测液的吸光度Ax，则待测液浓度cs可从下式求得 第四节 提高测量灵敏度和准确度的方法 一、分光光度法的误差 1、仪器测定误差 光电管灵敏性差、光源不稳定及读数不准。 透光率误差?T引起浓度误差?c： 透光率20% ~65%，A为0.2~0.7时，浓度相对误差较小。 2、溶液偏离Beer定律 偏离Beer定律，A-c曲线弯曲。主要原因： 化学因素 吸光物质发生解离、缔合、溶剂化等现象；