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土壤微生物多样性研究中总DNA提取技术进展 摘要：综述了在土壤微生物多样性研究中总dna提取技术的研究进展，分析了dna提取过程中的主要影响因素及存在的问题。 关键词：土壤微生物；多样性；dna；提取技术 中图分类号：s154.3 文献标识码：a 文章编号：0439-8114（2012）23-5253-06 advances of total dna extraction technology for soil microbial diversity research xiao bin，jiang dai-hua，liu li-long，liu quan-dong （college of agronomy，guangxi university，nanning 530005，china） abstract： the influencing factors and application aspects， as well as the potentials and limitations of dna extraction techniques for microbial diversity analysis were reviewed. applying appropriate methods to extract microorganism dna fragment that have right purity and appropriate size from soil were the precondition in soil microbial study on the molecular level， and the subsequent molecular biotechnology operations were all rely on these methods. key words： soil microorganism； diversity； dna； extraction method 土壤微生物多样性是生物多样性研究的一个重要领域，是指其在遗传、种类、结构与生态功能方面的变化，对指示土壤微生物群落的稳定性，在保持土壤质量和生态系统稳定性等方面具有重要意义[1]，是当今国内外关注和研究的热点问题之一。 长期以来，由于研究方法的限制，传统的分离纯化培养技术仅能获得土壤中微生物总种群数的1%左右，而绝大部分微生物目前还不能获得纯培养[2]，未能获得纯培养的微生物才是土壤微生物的主体，因此，有关微生物多样性研究进展不大。 近年来，随着分子生物学技术的发展和研究手段的更新，基于土壤微生物群落总dna的现代微生物分子生态学研究方法避免了传统分离培养方法的缺点，被广泛应用于土壤微生物群落结构、功能以及动态监测研究[3]。因此作为微生物群落分子分析方法的基础，最重要的一步就是从土壤样品中尽量毫无偏差地提取出高质量的、具有代表性的微生物总基因组dna。关于土壤微生物dna提取方法的报道很多[4，5]，然而这些方法主要侧重于土壤中的细菌群落，很少关注土壤中真菌群落总基因组dna的提取方法及其提取效果。另外，细胞裂解不完全、dna分子吸附在样品基质颗粒的表面、从样品中同时提取了某些重要酶的活性抑制剂、dna分子的损耗、降解和破坏等因素也影响着土壤微生物dna提取的质量，因而提取土壤微生物总dna在研究中尤为重要[6]。本文主要对dna提取过程中的主要影响因素、现行各方法的优缺点以及存在的问题作一综述。 1 基于dna方法的土壤微生物多样性研究现状 传统微生物学研究方法主要依赖于纯培养技术和显微镜技术，对土壤微生物多样性的描述与研究存在一定的局限性。20世纪中后期，随着土壤微生物多样性研究向多方面发展，人们尝试着利用分析微生物细胞中某种指示成分，如磷脂脂肪酸（plfa）来研究土壤微生物的种群组成，但是这些方法的缺陷是无法保证细胞中某种指示成分在土壤中的稳定性，并且如果某种微生物的plfa是未知的，则该不可培养微生物仍难以鉴别[7，8]。 1980年，torsvik等[9]首次建立了从土壤样品中直接提取细菌dna的方法，并于1990年将其成功应用于dna杂交技术，研究发现1 g土壤中有4 000个以上不同的细菌种类，说明土壤中微生物多样性是极其丰富的。后来研究者发现16s rdna在原核微生物中普遍存在，并且含有相对保守和可变区域，在不同的个体间16s rdna基因序列也不会进行基因交换，因此，每一种生物都有自己的独特序列。1986年，pace[3]第一次以16s rdna为基础确定环境样品中的微生物，使人们对大量不可培养微生物群体有了全新的认识。此后，基于16s rdna基因的指纹图谱分析的现代分子