氨苄青霉素抗性在大肠杆菌中应用研究.docVIP

学号：091201215 分子生物学实验论文 (2009级本科) 题 目：氨苄青霉素抗性在大肠杆菌中的研究 系（部）院： 农业与生物技术学院 专 业： 生物工程 作者姓名： 何增寿 完成日期： 2011年12月10日 二零一一年十二月 氨苄青霉素抗性在大肠杆菌中的研究 （农业与生物技术学院 工程09（2）班 何增寿 091201202） 摘要：为研究人工合成的氨苄青霉素在大肠杆菌中的抗性表达，利用PGEM--Teasy质粒为载体，把人工合成的抗氨苄青霉素的基因导入大肠杆菌，通过含有氨苄青霉素的培养基筛选出抗氨苄青霉素的基因的大肠杆菌，对筛选出的大肠杆菌进行质粒DNA提取,并对质粒进行PCR扩增和酶切电泳图分析。结果表明：人工合成的抗氨苄青霉素的基因在大肠杆菌中表达并复制。 关键字：氨苄青霉素 抗性 大肠杆菌 研究 引言：在分子生物学日益普及的今天, 基因操作已成为一项重要的常规技术。体外连接的DNA 重组体导入合适的受体细胞便能大量地复制、增殖和表达, 从而得到大量的重组基因。其中尤以转化为主。目前可以通过两种方法得到大肠杆菌感受态细胞的储存物: 第一种是通过商业途径购买冻存的感受态细胞, 其转化效率十分可靠, 一般可以达到108 的转化子/μg 质粒DNA, 但是相当昂贵, 通常选择的是自制感受态细胞的储存物。因此, 感受态细胞的制备是分子生物学研究中的一个重要环节, 其制备质量的好坏直接影响到后续实验工作的进行。 1 材料和方法 1.1 实验材料 1.1.1 供试材料：大肠杆菌（实验室提供） PGEM--Teasy质粒 Taq酶 1.1.2 仪器：基因扩增仪 移液器 电泳仪 紫外检测仪 恒温摇床 恒温水浴器 恒温培养箱 低温离心机 超净工作台 冰箱 离心管 小指管 1.1.3 试剂： PCR缓冲液(含Mg2＋) 4种dNTP Taq酶 DNA模板 两种引物（正向引物和反向引物） EB溶液 氯化钠(Nacl) 氨苄青霉素 氯化钙(CaCl2) 酒精灯 牙签 LB液体培养基 ddH2O 溶液Ⅰ（50 mmol/L 葡萄糖，25mmol/L Tris.HCl pH8.0,10 mmol/L EDTA） 溶液Ⅱ 0.4mol/L NaOH，2%SDS用前等体积混合 溶液Ⅲ 5 mol/L KAc 溶液60ml， 11.5 ml冰醋酸，28.5 ml 去离子水。 Tris.HCl RNase 溶液 1.2 方法 1.2.1 PCR基因扩增 1.2.1.1 按顺序向微量离心管中依次加入： ddH2O 35μl DNA 样品 1μl 10×PCR 缓冲液 5μl 2.1mmol/L dNTP 4μl 引物I 2μl 引物Ⅱ 2μl 混匀。 1.2.1.2 PCR反应参数 (1) 94℃预变性 5min (2) 94℃变性 1min (3) 47℃退火 1min (4) 72 ℃延伸 2min。 (5) 重复(2)-(4) 30次 （6）72 ℃延伸 10min。 （7）4℃保存 1.2.1.3 琼脂糖凝胶电泳检测PCR的结果：取10μl PCR扩增产物，琼脂糖凝胶电泳检测。保持电流40mA。电泳结束后，用EB染色15min，紫外灯下观察结果。 1.2.2 DNA重组 1.2.2.1 取灭菌的EP管，先后加入 PGEM--Teasy质粒1 μl ，2 μl酶切缓冲液， 1 μl E.coRI酶，无菌双蒸水15ul，至反应混合物总体积20ul，离心混匀，37℃反应3h。 1.2.2.2在另一灭菌的Eppendorf管中，加λDNA 1.5ug， 1μl酶切缓冲液，1 μl EcoRI酶，无菌双蒸水补到10ul，37℃反应3h。 1.2.2.3将酶解液加入1/10体积的3mol/LKAc溶液，在加2倍体积无水乙醇，-20℃冰箱，2h沉淀DNA。12000r/min 4℃离心15min，弃上清，加70%乙醇洗沉淀，再离心，去上清，真空干燥后，加5ulTE溶液。