聚丙烯酰胺凝胶电泳分离乳酸脱氢酶同工酶绪论.pptVIP

RNA样品的消化（为下周实验做准备） 每2组取3支消化管，按下表操作 编号 1 （空白） 2（样品） 3（标准） 试剂处理 RNA样品液 /mL — 1 — 标准磷原液 /mL — — 1 去离子水 /mL 1 — — 5mol/LH2SO4 /mL 2 2 2 加小漏斗，300℃加热沸腾10分钟，250℃左右继续 消化3～4小时至溶液透明，冷却，待用。 电泳装置 采用北京六一仪器厂的DYC型垂直板电泳装置： 制胶装置 制备凝胶板 电泳装置 进行凝胶电泳 每组（2人）做一块胶，两组共用一套电泳装置，两套电泳槽共用一台电泳仪。 3、灌胶液 沿玻璃板尽快加入两块玻璃板之间的缝隙中，注意不要有气泡，当凝胶液面距短板上缘0.3 cm时，立即轻轻将样品槽模板插入凝胶溶液中，注意样品槽中不要有气泡，凝胶溶液应充满样品槽间隙。制胶装置室温垂直放置，30~60 min聚合反应完成。 4、安装电泳槽 胶聚合后，拔起锲形固定板，取出夹有凝胶的玻板，取下凹形密封条，将凹形玻板侧朝内放入电泳槽架，重新用锲形板固定，密封不漏液。每槽取稀释10倍的电极缓冲液350mL，小心加入负极槽(内槽)约150mL，使其浸没过凹形玻板进入样品槽。双手轻轻、垂直、均匀用力拔出样品槽梳子。 小心将微量注射器伸入样品槽底部上方，不 要扎到凝胶，分别在每个加样槽内按下列 顺序和体积慢慢推入蓝色样品液(含蔗糖和少量 溴酚蓝)，使其沉降到底部形成集中窄的蓝带。 每位同学加四种，两边的槽不加。 心肌 脑 骨骼肌 肝 心肌 脑 骨骼肌 肝 5μL 10μL 5μL 3μL 5μL 10μL 5μL 3μL 将电泳槽架放入电泳槽内，倒入其余的电极缓冲液至正极槽(外槽)，按正负极位置放上电泳槽盖，盖紧，并按正负极连接上电泳仪。用稳压挡将电压调至80V，待样品蓝带全部进胶后，调高电压至150V，继续电泳，当指示剂溴酚蓝的蓝带泳动至胶底部并出胶后半小时到40分钟，关闭电源，停止电泳，前后共约2.5-3小时。 1. 学习聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)原理和有关同工酶的知识。 2. 掌握连续系统聚丙烯酰胺凝胶电泳分离乳酸脱氢酶同工酶及酶活性染色的操作技术。 （一）. 聚丙烯酰胺凝胶电泳原理 1. 电泳定义和蛋白质电泳基本原理 带电颗粒在电场作用下，向着与其电性相反的电极移动的现象。 许多生物分子都可带电荷，如蛋白质、核酸等，这些带电胶体颗粒在电场中均可移动。以蛋白质为例，根据已学生化知识，蛋白质在小于或大于其等电点的pH时，可带不同的净电荷，所以也有电泳现象。不同蛋白质质点带电性质、带电量多少、质点大小、形状都不同，决定了各自在电场中移动速率和距离不相同，因而互相之间得以分离。 2. 区带电泳 在一些惰性支持介质上进行电泳，电泳后不同组分由于带电多少不同，移动距离不同，在支持物上形成带状区间。 常见的惰性支持物有： 滤纸 称纸电泳 醋酸纤维素薄膜 薄膜电泳 淀粉、琼脂(糖)、聚丙烯酰胺凝胶 凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶为支持物的区带电泳。 3. 聚丙烯酰胺凝胶的形成与结构 *主要成分 单体：丙烯酰胺(Acr) 交联剂：N,N’- 甲叉双丙烯酰胺(Bis) 聚合反应 AP-TEMED催化体