α淀粉酶检测操作规程.docVIP

α-淀粉酶活力检测操作规程 1 酶活定义 1g固体酶粉（或1mL液体酶），于60℃、pH 6.0条件下，1h液化1g可溶性淀粉，即为1个酶活力单位，以u/g u/mL 表示。 2 原理 在一定温度和PH值条件下，α-淀粉酶将淀粉分子链中的α-1，4葡萄糖苷键随机切断成长短不一的短链糊精、少量麦芽糖和葡萄糖，而使淀粉对碘呈篮色的特异性反应逐渐消失，呈红棕色，其颜色消失的速度与酶活力有关，故可通过固定反应后的吸光度计算其酶活力。 3 仪器和设备 3.1 分析天平：感量0.0001g 3.2 精密pH计：精确至0.01 3.3 分光光度计：应符合GB9721有关规定 3.4 电热恒温水浴锅：30～100℃，±0.2℃ 3.5 计时器：每小时误差不超过5秒 4 试剂与溶液 4.1 原碘液：称取碘（I2）11g、碘化钾（KI）22g，用少量水使碘完全溶解，然后定容至500mL，贮于棕色瓶中。 4.2 稀碘液：吸取原碘液2.00ml，加碘化钾20g，用水溶解并定容至500mL，贮于棕色瓶中。 4.3 20g/L可溶性淀粉溶液： 称取可溶性淀粉2.000g，精确至0.001g，用水调成浆状物，在搅动下缓缓倾入70mL沸水中，然后，以30ml水分几次冲洗装淀粉的烧杯，洗液并入其中，加热至完全透明，冷却，定容至100mL。此溶液需要当天配置。 4.4 磷酸缓冲液（pH 6.0） 称取磷酸氢二钠（Na2PO4·12H2O）45.03g、柠檬酸（C6H8O7·H2O）8.07g，使水溶解并定容至1000mL。配好后用pH计校正。 5 分析步骤 5.1待测酶液的制备：称取酶粉1 g，精确至0.0002g（或吸取液体酶1.00mlL），先用少量的磷酸缓冲液溶解，并用玻璃棒捣研，将上请液小心倾入容量瓶，沉渣部分在加入少量缓冲液，如此捣研3～4次，最后全部移入100mL容量瓶中，用缓冲液定容到刻度（将估计酶活力除以4，即酶活理应在3.7～5.6u/mL范围内），摇匀，通过4层纱布过滤，滤液供测定用。 测定： 5.2.1 吸取可溶性淀粉溶液20.0mL于试管中，加入缓冲液5.00mL，摇匀后，于（60±0.2）℃的恒温水浴中预热5min。 5.2.2 加入稀释好的待测酶液1.00mL，立刻记时，摇匀，准确反应5min。 5.2.3立即吸取反应液1.00mL于稀碘液5.00ml中，摇匀，并以稀碘液做空白，于660nm波长下，用10mm比色皿，迅速测定其吸光度。根据吸光度查附表1，求得测试酶液的浓度。 6 计算 样品酶活力（u/g或u/mL） c×n 式中： c 表示测试酶液的浓度（u/mL） n 表示样品的稀释倍数 7 结果的允许差 平行实验相对误差不得超过2%。 附表 1 吸光度与测试α-淀粉酶酶浓度对照表 吸光值 酶浓度 u/ml 吸光值 酶浓度 u/ml 吸光值 酶浓度 u/ml 吸光值 酶浓度 u/ml 0.100 4.694 0.140 4.492 0.180 4.301 0.220 4.132 0.101 4.689 0.141 4.487 0.181 4.297 0.221 4.128 0.102 4.684 0.142 4.482 0.182 4.292 0.222 4.124 0.103 4.679 0.143 4.477 0.183 4.288 0.223 4.120 0.104 4.674 0.144 4.472 0.184 4.283 0.224 4.116 0.105 4.669 0.145 4.467 0.185 4.279 0.225 4.112 0.106 4.664 0.146 4.462 0.186 4.275 0.226 4.108 0.107 4.659 0.147 4.457 0.187 4.270 0.227 4.105 0.108 4.654 0.148 4.452 0.188 4.266 0.228 4.101 0.109 4.649 0.149 4.447 0.189 4.261 0.229 4.097 0.110 4.644 0.150 4.442 0.190 4.257 0.230 4.093 0.111 4.639 0.151 4.438 0.191 4.253 0.231 4.089 0.112 4.634 0.152 4.433 0.192 4.248 0.232 4.085 0.113 4.629 0.153 4.428 0.193 4.244 0.233 4.082 0.114 4.624 0.154 4.423 0.194 4.240 0.234 4.078 0.115 4.619 0.155 4.418 0.19