07-硕士研究生课-后基因组学-章跃陵-转录组学研讨.pptVIP

一、产生背景 2006年5月，人类基因组的1号染色体测序完成，标志着人类已经完成自己基因组23条染色体中的22条染色体。同时，越来越多的基因测序工作也已完成，接下来的问题是： 这些基因的功能是什么？不同的基因参与了哪些细胞内的哪些生命过程？相同的基因在不同的细胞内或者疾病和治疗状态下表达水平有何差异？等等。 因此，在人类基因组项目完成后，转录组的研究迅速受到科学家的青睐。 二、概念 转录组是转录后所有mRNA的总称。 转录组学（transcriptomics）是在基因组学后新兴的一门学科。 即转录组学是对细胞（生物体）在某种条件下所有转录产物（即转录组）进行系统研究。 也就是说在RNA水平研究基因表达的变化。 ●转录组与基因组的区别 与基因组不同的是，转录组的定义中包含了时间和空间的限定。 同一细胞在不同的生长时期及生长环境下，其基因表达情况是不完全相同的。 人类基因组包含有30亿个碱基对，其中大约只有2.5万个基因转录成mRNA分子，转录后的mRNA能被翻译生成蛋白质的也只占整个转录组的40%左右。 通常，同一种组织表达几乎相同的一套基因以区别于其他组织，如：脑组织或心肌组织等分别只表达全部基因中不同的30%而显示出组织的特异性。 三、主要研究技术及应用 目前应用于转录组学的研究技术主要有： 1、差异显示（DD） 利用一系列的oligo(dT)引物，逆转录真核生物细胞中全部表达的mRNA，通过PCR扩增的方法，转换成cDNA双链，再利用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，将有差异的片段分开，筛选出目的基因。 该技术由于充分利用PCR技术和反转录，因此比较快速，且利用该技术能够观察细胞中mRNA的组成，了解植物不同发育阶段或不同环境条件下的细胞之间的差异表达，克隆目的基因。但存在操作繁锁，假阳性高，上调表达难于分析。 如：Bachem 等［5］利用差异显示技术，揭示了马铃薯块茎在不同发育阶段的基因表达情况，并同时比较了马铃薯块茎不同发育时期的mRNA表达情况，认为在块茎形成过程中有2个lox基因，不同时期产生的mRNA数量不同。 2、抑制消减杂交（SSH） SSH是1996年Diatchenko等提出的抑制PCR与消减杂交技术相结合的更简单更快速的分离差异基因的方法。 该方法运用了杂交二级动力学原理,即丰度高的单链DNA在退火时产生同源杂交的速度快于丰度低的单链DNA,从而使原来在丰度上有差别的单链DNA相对含量达到基本一致。而抑制PCR则是利用链内退火优于链间退火的特点,使非目的序列片段两端反向重复序列在退火时产生类似发卡的互补结构,无法作为模板与引物配对从而选择性地抑制了非目的基因片段的扩增。这样既利用了消减杂交技术的消减富集,又利用了抑制PCR技术进行了高效率的动力学富集。 如：国家海洋局第三海洋研究所徐洵研究小组以日本对虾Penaeus japonicus为研究对象，运用抑制性消减杂交技术分别在WSSV抗性对虾和病原菌注射对虾体内发现了35种与WSSV抗性有关的基因和25种与病原菌应激性有关的基因（He NH et al.，2003；Pan D et al.，2005）。 中山大学何建国研究小组以WSSV抗性和易感性凡纳滨对虾Litopenaeus vannamei 为研究对象，采用抑制性消减杂交技术鉴定了40种与WSSV抗性相关的基因，其中漆酶、羧肽酶B、凝集素、锌指蛋白酶等30种蛋白表达上升，而另外10种基因表达下降（Zhao Z Y et al.，2007）。 3、基因表达序列分析（SAGE） 基因表达序列分析( serial analysis of gene expression,SAGE）是由美国Kenneth等于1995年最先报道,该技术从某一转录本(mRNA)的确定位置分离一小段核苷酸作为标记序列(TAG),通常为9－11bp。给这些标记序列做上一定的标志(Marker),将其随机连接、扩增、克隆,选择一定数量的克隆产物进行测序分析。以标志物将标记序列彼此区别,其标记序列代表相应的转录本,其重复出现的次数代表转录本拷贝数,即mRNA水平。 SAGE技术最大的优势是在对基因性质预先不了解的前提下研究由细胞转录变化引起的生物现象,在较短时间内检测细胞内几乎所有的mRNA,得到其拷贝数,同时可发现潜在的未知基因。 如Kenneth利用自己发明的SAGE技术将已扩散到肝脏的克隆癌细胞的基因表达与那些未扩散的和正常克隆细胞的基因表达相比较,发现了一个酪氨酸磷酯酶(phospha- tase of rvegenerating liver,PRL)促进了基因的表达,过量PRL酶帮助了癌细胞扩散。 4、基因芯片（DNA microarray） 与SAGE方法几乎同时出现的是基因芯片（DNA micro