核糖体展示技术.pptVIP

核糖体展示技术 (Ribosome Display Technology, RDT) 是由Plückthun 实验室在多聚核糖体展示技术的基础上改进而来的一种利用功能性蛋白相互作用进行筛选的新技术，它将正确折叠的蛋白及其 mRNA同时结合在核糖体上， 形成mRNA-核糖体-蛋白质三聚体，使目的蛋白的基因型和表型联系起来，可用于抗体及蛋白质文库选择、蛋白质体外改造等。运用此技术已成功筛选到一些与靶分子特异结合的高亲和力蛋白质， 包括抗体、 多肽、 酶等， 是蛋白质筛选的重要工具。 原理 核糖体展示技术通过聚合酶链反应 （PCR）扩增DNA文库，同时引入T7 启动子、核糖体结合位点及茎-环结构， 将其转录成 mRNA，在无细胞翻译系统中进行翻译， 使目的基因的翻译产物展示在核糖体表面，形成“mRNA-核糖体-蛋白质” 复合物，构成核糖体展示的蛋白文库， 然后用相应的抗原从翻译混合物中进行筛选， 以乙二胺四乙酸（EDTA）解离结合的核糖体复合物或以特异抗原洗脱整个复合物，并从中分离mRNA。通过反转录聚合酶链反应（RT- PCR） 提供下一轮展示的模板，所得 DNA进入下一轮富集，部分 DNA可通过克隆进行测序分析等。 启动子是基因的一个组成部分，控制基因表达（转录）的起始时间和表达的程度。启动子（Promoters）就像“开关”，决定基因的活动。启动子也应由DNA组成。启动子本身并不控制基因活动，而是通过与称为转录因子的这种蛋白质结合而控制基因活动的。质粒设计时都需要加入启动子序列，以保证目的基因的表达。启动子可分为诱导型启动子和组成型启动子两大类，后者包括CMV，SV40，T7, pMC1，PGK启动子等 。 产生 Kawasaki 曾建议采用类似的途径从肽库中筛选多肽配体。在此之前，利用前期多肽抗体进行免疫沉淀，已经分离到了与核糖体和多肽偶联的mRNA。Mattheakis等人首次将前人的设想付诸实践，建立了筛选多肽类配体的多聚核糖体展示技术，并从一个库容为10^12的肽库中，筛选到亲和力常数达到10^9 (nmol级) 的固定化单抗的多肽配体。Gersuk等人利用该技术也筛选到前列腺癌肿瘤标记的多肽配体。体外翻译时，蛋白或多肽的折叠与翻译同步进行。与核糖体结合的天然多肽也具有酶活性。 这些研究结果说明，如果某种蛋白质的折叠不受核糖体蛋白通道的影响，那么与核糖体的解离就不是该蛋白获得天然构像的必要条件。1997年，Plückthun实验室在以上研究成果的基础上，对Mattheakis的多聚核糖体展示技术进行了改进，建立了体外筛选完整功能蛋白(如抗体）的新技术：核糖体展示技术。 操作步骤 1.基因片段的改造 为了使基因片段能有效转录和翻译,5′端应接上T7启动子序列和SD序列，去掉3′端的终止密码子,从而成功地使核糖体停留在mRNA3′末端,将蛋白质和mRNA连接在一起。在对基因片段改造时,常进行多次延伸PCR： ①分别将需要的基因片段和间隔序列各自扩出来 ②用引物 4 和引物 5 做连接 PCR 将目的基因和间隔子连接起来，引物5含有SD序列, 引物4含有3′端茎环结构序列。 ③ PCR产物再进行延伸PCR,引物6含有T7启动子序列和5′端茎环结构序列,下游产物同前。最后得到的PCR产物,5′端接上T7启动子和茎环结构以及SD序列,3′端则融合了间隔序列并含有3′端的茎环结构。 2.体外转录和翻译 体外表达可以利用来自原核的E.coliS30无细胞蛋白质合成系统,或真核的兔网织红细胞裂解液和麦胚提取物的蛋白质合成系统,至于何种系统更适合,目前尚有争议.体外转录与体外翻译可以偶联进行,也可以分别进行.目前,已有以DNA 为模板的体外蛋白翻译系统和以RNA为模板的体外转录与翻译偶联的商用系统问世。 （1）对于含二硫桥的ScFv抗体(单链抗体）和其它蛋白质,转录和翻译应分别进行,因为含有二硫桥的蛋白质要在氧化条件下才能正确折叠,但转录时,T7 RNA聚合酶要求具还原性的β-巯基乙醇维持其稳定性。如果目标蛋白在还原性条件下能正确折叠,则体外转录/翻译偶联体系效果可能更好.。 （2）若分别进行,则需要控制RNase的影响。VRC—过渡态类似物—作为RNase抑制剂,能有效抑制核酸酶,提高E.coli核糖体展示效率。翻译结束后立即冷却反应混合物,所有筛选步骤在冰上进行降低RNase的影响。另外,3′端和5′端的茎环结构也可以使mRNA避免核酸外切酶RNaseⅡ和核酸内切酶RNase E的影响。 3.亲和筛选 体外翻译反应结束后,将翻译混合物稀释4倍终止反应。反应试剂中始终保持5 mmol/L Mg2+浓度，稳定mRNA-核糖体-蛋