2-2章大肠杆菌分子克隆载体详解.pptVIP

三、λ -DNA载体的构建 λ噬菌体的缺陷： ⑴ 基因组太大（49kb）； ⑵ 酶切点太多，它有5个BamH1位点（G↓GATCC），6个BgⅠ位点（A↓GATCT），5个EcoRⅠ位点（G↓AATTC）。 ⑶ 野生型只能接纳一定长度的DNA。 λ噬菌体的改造 ⑴ 切去非必须区段，在切去的同时，加载目的基因（2.5kb或更大）； ⑵ 去掉太多的酶位点，每种酶只留1-2个切口； ⑶ 增加标记基因； (4) 引入无义突变。 载体类型 插入型载体 通过特定的酶切位点允许外源DNA片断插入的载体（0-11kb) 。 置换型载体 允许外源DNA片断替换非必需DNA片断的载体(9-23kb)。 体外包装 插入位点 体外包装 插入片段 体外包装 体外包装 插入片段 插入片段 四、λ-DNA载体的选择标记 1. 基因组大小 48.502kb , 75-105%，60%, 9-23kb 范围内。 2．lacZ 基因 IPTG/X-gal 3. 基因 cⅠ 失活 4．Spi 筛选 野生型的l噬菌体不能在P2噬菌体溶源性的细菌中繁殖（Spi+），这种生长抑制表型受λ-DNA上的red和gam两个基因控制。若将外源DNA取代red和gam，重组噬菌体便拥有Spi-表型，能在P2噬菌体溶源性的大肠杆菌受体菌中繁殖，并形成透明斑。 五、代表性λ噬菌体载体 插入型载体 λgt10 载体 替换了一段来自 ?434 噬菌体的片段 imm434 ，其中基因 cⅠ 内有一个 EcoRⅠ 位点。 置换型载体 EMBL3 在填充片段两端带有对称的多克隆位点 ， Spi 筛选重组体 M13、f1、fd 噬菌体 单链环状DNA的丝状大肠杆菌噬菌体： M13 噬菌体 （2）复制型（RF）是双链环状DNA。 单链DNA噬菌体的特点 （3）RF DNA和ssDNA都能转染感受态大 肠杆 菌。并产生噬菌斑。 （5）可产生大量的含有外源DNA插入片 段的单链分子，便于作探针或测序。 （1）+DNA。（ssDNA） （4）不存在包装限制。 M13噬菌体 M13 J. Messing证明，IG区存在M13的复制起点，但可以插入外源DNA而不影响M13噬菌体的活力。 M13的生活周期 不导致溶菌，但可使细菌生长变慢，约为正常的1/2—3/4 M13通过雄性细菌的F性菌毛注入其+DNA +DNA合成－DNA，形成RF dsDNA －DNA转录mRNA、合成+DNA、翻译形成噬菌体蛋白 组装成新的噬菌体M13，挤出寄主细胞 M13噬菌体的生物学特性： 感染周期 + DNA （+）DNA RF DNA RF DNA RF DNA - DNA II M13噬菌体载体的构建 利用双链状态的RF DNA,噬菌体DNA中含有双链外源DNA片段中的一条链。 III VI I IV II X V VII IX VIII III VI I IV II X V VII IX VIII 野生型M13RF-DNA M13mp系列载体 lacZ’ polylinker M13 DNA载体的特点 （1）使克隆的DNA片段以特定单链的形式输出受体细胞外,这在DNA定向突变中非常有用 (2)M13重组分子筛选简便 被M13噬菌体感染的受体细胞生长缓慢，形成混浊斑，易于辨认挑选。而且重组分子越大，混浊度越大 (3)M13噬菌体载体总是成对出现，获得双链DNA中的任意一条单链 (4)但M13-DNA载体的最大缺陷是装载量小，只有1.5 kb （1）粘粒（cosmid） 能容纳大片段（45kb）的小分子（4kb～ 6kb）载体。 组成：质粒复制原点，抗药基因，多克隆位点，已连接入的λcos位点。 构建基因文库的λ载体 （2）λDNA的体外包装 是提高λ噬菌体转染效率的有效方法 在A蛋白（有终止复制功能），E蛋白（是包装蛋白），D蛋白（是插入蛋白）共同作用下使重组体DNA转入头部。 四. COS质粒载体 1. 结构特点：在普通质粒载体中插入一个或两个来自λ的cos位点片段, 双cos载体比单cos载体易于重组 l?? cos位点的精细结构 cos长200 bp，由以下几个亚单位组成： a. cosN—由λ末端酶的gpA亚基识别和切割，产生5-12 n.t突起； b. cosB—分别位于cosN的两侧，称之为cosBL（左侧）和cosBR（右侧），为蛋白