07免疫组化的特异性与敏感性2解说.ppt

* 第七章. 免疫组化的特异性与敏感性 (The specificity and sensitivity of Immunohistochemistry) I. 特异性 II. 特异性与非特异性染色 III. 对照试验 IV. 提高敏感性的方法 I. 特异性 A. 方法特异性: 说明染色结果是由免疫组化反应引起的. B. 血清特异性: 说明染色结果指由免疫组化中的抗原抗体反应引起, 同时要排除交叉反应. II. 特异性与非特异性染色 A. 特异性染色: 由一抗与待检抗原发生特异性免疫反应而产生的染色. 新发现的阳性结果需多次多方法重复实验证实. B. 非特异性染色: 由组织细胞中非抗原-抗体反应引起的染色, 常无结构基础并弥漫存在, 或多次染色的结果相互矛盾. 常见于组织切片的边缘 (边缘效应)或人工损伤部位. III. 对照试验 A. 阳性对照: 证明染色方法和试剂的有效性. B. 阴性对照: 必不可少, 证明染色结果的有效性. 如出现阳性即为假阳性. 1. 空白试验: 用稀释抗体的缓冲液(PBS, TBS等)替代一抗. 2. 替代试验: 用相同稀释度的NGS(与制备一抗的动物种属相同)代替一抗. 使用多克隆抗体时, 阴性对照必须采用替代实验. 3. 阻滞试验: 先用过量的未标记特异性抗体再用标记特异性抗体孵育组织. 4. 吸收试验: 用过量特异性抗原吸收抗血清后再染色. 最有效. 当抗体与组织第一次结合实验或使用一个新抗体时, 必须进行吸收试验. IV. 提高敏感性的方法 A. 增强特异性染色: 1. 选用敏感的方法: 选用PAP法, ABC法和免疫金银法等敏感的方法, 增加抗原上标记物数目, 增加免疫反应产物的量. 2. 增加抗体孵育时间: 高稀释度一抗4℃过夜而非室温2小时. 也可以增加二抗和终抗的孵育时间. 3. 重复抗体或检测试剂层数: a. 重复一抗: 一抗孵育后彻底清洗后再用一抗孵育. b. 重复二抗和PAP复合物(双桥法): 在PAP法中, 用PAP复合物作用后, 重复使用二抗和PAP复合物, 最后再显色. 小鼠中脑黑质酪氨酸羟化酶(Tyrosine hydroxylase)阳性神经元, ABC法染色, DAB-H2O2-硫酸镍铵显色. 1994. 4. 增加抗原与抗体的接触: 蛋白酶消化, 抗原修复和提高抗体和检测试剂对组织的穿透力. 5. 加强DAB反应产物的着色: a. 锇化: DAB显色后用0.01~1%OsO4处理30秒出现棕黑色. 锇化后可用于EM观察. b. 镍加强法: 在0.05%DAB-0.01%H2O2显色液10ml中加50?l 8%的氯化镍(Nickel chloride, NiCI2). DAB反应产物呈紫蓝色. B. 背景染色的来源及消除方法: 1. 固定失败: 抗原位移扩散而引起背景染色. 2. 染色过程中切片干燥: 造成严重的非特异性染色, 应尽量使用湿盒. 3. 内源性酶活性: 内源性酶如脑组织, 巨噬细胞和粒细胞等的过氧化物酶或红细胞等的铁卟啉(Ferriporphyrin)的假过氧化物酶可导致假阳性. 可在加一抗之前用0.3%H2O215~30分消除. 若破坏抗原性则在一抗后使用. 4. 游离醛基: 以醛类固定的组织可存在游离醛基(Aldehyde group). 用1%硼氢化钠(Sodium borohydride, NaBH4), 20mM赖氨酸(Lysine)或甘氨酸(Glycine), 0.1M NH4Cl, 白蛋白(Albumin)或NGS等封闭游离醛基. 5. Fc受体: 有些组织含有IgG的Fc受体. 加一抗前用3%产生一抗(直接法)或二抗(间接法)的同种动物的正常血清处理切片10~20分(SPA法染色时用0.1% EA). 6. 天然抗体和杂质抗体: a. 天然抗体: 免疫动物时其体内已经存在的抗体. b. 杂质抗体: 在制备抗体时因免疫原中的杂质而引起的抗体. c. 处理方法: 用PAP等敏感方法和高效价的抗体, 或用通过高度稀释的抗血清来降低背景染色. 载体蛋白的抗体可用载体蛋白吸收抗血清除去. *