5.01_基因工程的工具酶解说.pptVIP

主要内容 1 限制性核酸内切酶 2 DNA连接酶 3 DNA聚合酶 4 修饰酶 1 限制性核酸内切酶 1.2 限制性核酸内切酶的命名 命名原则： 第一个字母（大写, 斜体）： 该酶来源的微生物属名； 第二、第三个字母（小写、斜体）：微生物的种名； 若该微生物有不同的变种和品系，再加上该变种和品系的第一个字母（大写） 若从同一微生物发现多种限制性内切酶，则依照发现和分离的先后顺序用罗马字母表示。 1.3 限制性核酸内切酶的分类 1.3.1 Ⅰ 型限制性内切酶 1.3.2 Ⅱ 型限制性内切酶 1.3.3 Ⅲ 型限制性内切酶 1.3.1 I型限制性内切酶 功能：限制、修饰 特点：需Mg2+、ATP和S-腺苷蛋氨酸为辅助因子；识别位点和切割位点不一致，没有固定切割位点（随机性）； 应用：不常用。 1.3.2 III型限制性内切酶 功能：限制、修饰 特点：需Mg2+、ATP和S-腺苷蛋氨酸为辅助因子；特异切割，切割位点在识别位点外，距识别位点3`端24-26bp处。 应用：数量很少，分子克隆中无实际作用。 1.3.3 II型限制性内切酶 功能：识别并特异切割DNA分子。 即通常所指的DNA限制性核酸内切酶； 反应特点：仅需Mg2+作为催化反应的辅助因子，能识别双链DNA的特殊序列，并可特异切割DNA，产生特异性的片段； 应用：种类繁多，分子克隆中最常用的内切酶。 (1) 基本特性 识别长度为4-8个核苷酸的特异序列； 许多识别序列具回文结构，如Hind Ⅲ 的识别序列： 5` AAGCTT 3` 3` TTCGAA 5 切割产生的末端有粘端 (cohesive/sticky end) 如BamH I (G↓GATCC) 和平端 (blunt end) 如Sma I (CCC ↓GGG) 限制性核酸内切酶可分为三大类: I类 能识别专一的核苷酸顺序,并在识别点附近切割双链,但切割序列没有专一性.II类 识别位点(回文序列)严格专一,并在识别位点内将双链切断 III类 识别位点严格专一(不是回文序列),但切点不专一,往往不在识别位点内部. 因此在基因工程中具有实用价值的是II类限制性内切酶. 限制酶的识别位点 （1）Ⅱ型酶识别的特殊DNA序列称为限制酶的识别位点（或切割位点）。 （2）它能识别dsDNA的4－6bp的回文序列并水解该部分的核苷键。一般来说是4－6bp，有6个以上的，但没有4个以下的。 （3）识别顺序呈二重对称，即1800旋转对称。如： GC CG GTNAC GAA TTC Hha CG GC MaeⅢ CANTG EcoRⅠ CTT AAG (4)酶靶顺序大小是很重要的，它决定产生特定DNA中段的大小。 若DNA碱基组成是均一的，限制酶切点是随机的，那么对于： ①?要求4bp靶序列如HpaⅡ,MboⅠ等在庞大DNA链上平均44核苷酸即可遇到一个靶序列，即1/256 ②?同理，要求6bp的酶，则平均46遇到一个靶序列，即1/4096。 识别位点在DNA分子中的频率对于特定的限制性酶在DNA分子中的识别位点数目是可以计算的,四碱基的酶平均大约每256个核苷酸(44)有一个识别位点,而六碱基的酶大约4096(46)个核苷酸有一个识别序列,计算是在假定核苷酸随机排列的情况下进行的. 实践中这种方法不完全正确,如λ DNA长49kb,对于六碱基的酶应该有12个切割位点,实际上要少一些,如Bgl II只有6个,BamHI只有5个,而SalI只有2个. 限制酶的切割位点： 限制性对dsDNA 2条链同时切割（其具体切割点，即磷酸二酯键断开的位点，相对二重对称轴的位置而异）产生3种不同切口： 1.形成平头末端（flush或bluntend）如 2.形成5′－粘性末端 （5′－cohesive end即3′延伸末端） 3.形成3′－粘性末端（3′－cohesive end） 粘性末端（sticky end） (2) 同功异源酶 来源不同但能识别和切割同一位点的酶称为同功异源酶 (isoschizomer), 有时也称同裂酶。 如：BamH I (G↓GATCC)和Bst I (G ↓GATCC) 有一些同功异源酶对于切割位点上的甲基化碱基的敏感度有所不同。 (3) 同尾酶 有些限制酶识别序列不同，但是产生相同的粘性末端，这些酶称为同尾酶（isocaudamer) 如：