淋巴细胞分离、E花环要点分析.pptVIP

淋巴细胞分离、E花环 微生物免疫教研室 实验目的 掌握密度梯度离心法分离外周血淋巴细胞的的原理和方法。 掌握E花环测定原理和判定标准 熟悉E花环测定操作方法 实验原理 外周血淋巴细胞分离常用方法是聚蔗糖-泛影葡胺密度梯度离心法。PBMC与血液中的其他成分存在密度差异，利用密度在1.077±0.002之间，而且近于等渗的Ficoll-Hypaque混合溶液（称为淋巴细胞分层液）作密度梯度离心时，各种血液成分将按密度梯度重新分布聚集。血浆和血小板由于密度较低，故悬浮于分层液的上部；红细胞与粒细胞由于密度较大，故沉于分层液的底部；PBMC密度稍低于分层液，故位于分层液界面上，这样就可获得淋巴细胞。 实验材料与试剂 ①肝素（100U/毫升）、D-Hanks液、 淋巴细胞分离液（ficoll）、瑞氏染液 ②离心机、显微镜、试管，吸管等。 实验方法与步骤 1、采集兔静脉血，注入盛有肝素（20U/ml）的搪瓷缸中，立即轻轻摇匀，使血液抗凝。 2、每组用吸管吸取2ml抗凝血，加入等体积即2ml的室温D-Hanks液，使血液等倍稀释。 3、每组取已加入2ml淋巴细胞分离液的试管1支，将离心管倾斜45?角，在距分层液界面上1cm处将稀释血液沿试管壁缓慢加至分层液上面，每管4ml，注意保持两者界面清晰，勿使血液混入分层液内。 4、2500转/分离心20min，离心后，管内可分为四层：上层为血浆、血