稀土金属元素标记行为考察汇总.doc

稀土金属元素标记行为考察 林虹君1 冯流星2张爱红3 韦 超2 王 军2 王 昕3 张养军1 蔡耘1 钱小红*1 1（蛋白质组学国家重点实验室，北京蛋白质组研究中心, 军事医学科学院放射与辐射医学研究所，北京，102206） 2（中国计量科学研究院，北京，100013） 3（防化学院，北京，102205） 摘　要 稀土金属元素因其与双功能试剂螯合效率高、对肽段的反相色谱行为和质谱的离子化效率影响小、检测背景低以及过量金属离子在检测时不会产生干扰等优点，近年来已经在生物标记结合质谱定量分析研究领域引起了关注。本研究选取稀土金属中单同位素元素铽（Tb）、钇（Y）、铥（Tm）、钬（Ho）和镥（Lu）5种元素，通过双功能试剂二乙三胺五乙酸双酸酐（DTPA双酸酐）对合成肽段及蛋白质酶切产物标记的过程进行了研究，包括对标记条件进行了优化以及对该质量标签的色谱行为和共洗脱、标记稳定性、离子交换、动态范围、质谱检测限等现象进行了考察，结果表明铥和钬两元素结合效率最高，分别达到了92.5%和89.9%；稳定性考察结果表明质量标签在4 ℃放置一周仍有95%被检测到，若将标记好的标签用于定量研究，则放置时间不能超过两周；多金属标记质量标签可以共洗脱；在两种金属浓度差不超过6倍时，由离子抑制带来的影响较小。离子交换结果表明，只有很少部分发生了离子交换，对标记实验没有影响。 关键词 稀土金属，质量标签，基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱定量方法包括标记和非标记方法，而非标记方法是半定量方法，限制了其在定量研究中的应用方法。蛋白质标记方法主要有化学标记和生物标记，化学标记包括：乙酰化标记、同位素标记和ITRAQ标记，等；生物标记包括：SILAC标记等（如18O标记）是常用的标记方法，，因此寻求其它标记方法是定量研究的一个重要内容。 2. 1　仪器和试剂 基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱仪 4800 MALDI TOF/TOF Analyzer，美国ABSCIEX公司 ；真空离心干燥机（SC100A Speedvac Plus MODULYOD-230，美国Thermo Savant公司）；高效液相色谱仪（P230，大连依利特分析仪器有限公司）；纯水系统（Milli Q，Merck Millipore公司）。 二乙三胺五乙酸双酸酐 diethylenetriamine-N,N,N,N,N,-pentaacetic acid dianhydride，DTPA双酸酐 ，四氮杂环十二烷四乙酸（DOTA）：日本DOJINDO公司；三乙二胺碳酸盐 Triethylammonium bicarbonate, TEAB ：美国Sigma公司；乙腈（HPLC级）：美国J.T.Baker公司；乙酸、醋酸铵均为分析纯：北京化工厂；TbCl3、YCl3、TmCl3、HoCl3和LuCl3均为分析纯：中国计量科学研究院。 2. 2　实验方法 2. 2. 1　样品制备 TEAB：0.05 M，pH 7.0；醋酸铵：0.1 M，pH 6.0。 2. 2. 2　质谱分析 对样品分析时，取5 μL处理好的样本溶液，与饱和的基质溶液 5 mg/mL CHCA，溶于含0.1% TFA的50%乙腈中 按照1:9的比例混合，取0.6 μL点靶，在空气中挥发干燥，在基质辅助激光解析电离/飞行时间串联质谱仪上进行质谱分析。 数据采集条件：正离子反射模式（MS-1KV），加速电压20 KV，扫描范围m/z 700~1600，谱图采集软件为4000 series，累计采集1500~2000次。 根据同一肽段与金属元素标记后与标记前质谱峰峰高的比值来评估反应进行的完全程度，从而确定标记反应的最佳条件。用标准多肽混合物进行质谱仪的外标校正。 3　结果与讨论 3. 1标记元素的选择用单同位素降低质谱的复杂程度。89Y、159Tb、165Ho、169Tm、和175Lu作为研究对象对质量标签的稳定性、色谱和质谱等行为进行了考察。 表1 稀土元素中的单同位素元素 Table 1 monoisotopic elements in lanthanide elements Element 89Y 139La 140Ce 141Pr 159Tb 165Ho 169Tm 175Lu 89Y 50 51 52 70 76 80 86 139La 1 2 20 26 30 36 140Ce 1 19 25 29 35 141Pr 18 24 28 34 159Tb 6 10 16 165Ho 4 10 169Tm 6 175Lu 表2 8种单同位素元素与DTPA双酸酐的螯合常数 Table 2 The constants of eight single isotope elements che