蛋白质浓度测定Km测定DNA提取.ppt

蛋白质浓度测定方法比较 * 基因组DNA提取及鉴定 1、0.1g 细胞→ 2ml epp，混匀。 2、＋700μl bufferA，65℃，10m’，中间混匀一次 3、＋苯酚350μl，＋氯仿350μl，混匀5m，12000rpm，5m’ 4、上清500μl 至1.5ml epp，＋500μl（等体积）氯仿， 混匀5m’，12000rpm，10m’ 5、上清400μl至1.5ml epp，＋异丙醇400μl（0.7-1×）， 12000rpm，2m’，（掏出DNA，毛细管） 6、沉淀用70%乙醇洗2次，每次10m’ 7、自然凉干（15m’），＋30μl TE（或ddH2O），充分溶解 做好标记，上交！ 8、琼脂糖凝胶电泳鉴定 一、 实验目的 学习三种蛋白质浓度的测定方法，并比较优缺点。 二、 实验原理与步骤 OH－ 磷钼酸、磷钨酸 Pr+CuSO4 →→→ Pr-Cu络合物（紫红色）→→→蓝色化合物 蛋白质测定的范围：25－250μg/mL 标准蛋白BSA 250μg/mL 测定波长：660nm 1、 Lowry法（Foling-酚法） 反应原理： 测定步骤：标准蛋白BSA 250μg/mL （1）依次向试管中加入试剂： （2）A660——[Pr]作图，求待测蛋白浓度 A660 0.5 （前台用枪取） 立即振摇，30℃水浴20分钟 试剂乙（mL） 5.0 室温反应10分钟（双缩脲反应） 试剂甲（mL） [Pr](μg/mL) 0 0 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 D.W(mL) 1.0 1.0 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 BSA(mL) 待测1， 待测1 6 5 4 3 2 1 管号 原理：蛋白质分子中Tyr, Try, Phe的苯环含有共轭双键，因此蛋白质具有UV吸收的性质，吸收高峰在280nm处。 测定范围：0.1－1mg/mLpr 测定波长：280nm 标准蛋白BSA： 1mg/mL 测定步骤： （1）向各试管中依次加入各种试剂： （2）以A280nm-[Pr]作标准曲线，求待测蛋白浓度 A280nm [Pr](mg/mL) 0 0 0 1.0 2.0 3.0 3.5 4.0 D.W(mL) 4.0 4.0 4.0 3.0 2.0 1.0 0.5 0 BSA（mL） 待测1， 待测1 6 5 4 3 2 1 管号 2、紫外线（UV）吸收法： 3、考马斯亮蓝显色法（Bradford法） 实验原理：[Pr]↑→→→→CBBG-250-Pr复合物 ↑→→→A595↑ 　 标准蛋白BSA： 250μg/mL 操作步骤： （1）依次向各试管中加入各种试剂： （2）以A595nm-[Pr]作标准曲线，求待测蛋白浓度 A595nm 5.0 CBBG-250（mL） [Pr](μg/mL) 0 0 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 D.W(mL) 1.0 1.0 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 BSA（mL） 待测1， 待测1 6 5 4 3 2 1 管号 比较三种方法的优缺点！ 蔗糖酶km值的测定 一、实验目的： 　　掌握蔗糖酶km测定的实验方法。 二、实验原理： 蔗糖酶是一种水解酶，催化反应：蔗糖+水→→G+F 每水解1molS，生成2mol还原糖，因此可用比色皿测定还原糖量，即可知底物的水解速度。还原糖可还原3，5-二硝基水杨酸（DNS）生成红棕色的氨基化合物，即3-氨基-5-硝基水杨酸。 三、实验步骤 4.5 4.25 4 3.5 3 2.5 2 1 0.5 0.75 1 1.5 2 2.5 3 4 1 2 3 4 5 6 7 8 H2O （ml） 蔗糖 （ml） 管号 ↓ 每管加酶液0.5 ml（前台用枪加) ↓ 37℃准确作用5 min ↓ 加NaOH 0.5 ml(前台用枪加） ↓ 每管取0.5ml（前台用枪取） ↓ 加DNS 0.5ml（前台用枪取） ↓ 沸水浴3min ↓ 冷却 ↓ 加DW 4ml ↓ A520 取8只试管，按下表分别加入如下试剂： 以1/A520——1/S作图，求Km *