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第四章 核酸的定量和纯度检测 提取的总DNA、RNA或载体DNA，外源目的DNA片段，必须对其浓度、纯度、构型、分子量大小等基本情况进行了解，以下几种方法从不同角度对DNA或RNA进行了鉴定。 紫外光谱分析法 核酸的最大吸收波长为260 nm，蛋白质为280 nm，在260nm波长时，用标准样品测得每毫升l微克DNA钠盐溶液的吸光度值为0.02，即在1 OD值相当于双链DNA浓度为50 ug/ml，单链DNA或RNA为40 ug/ml，单链寡聚核苷酸的含量为30 ug/ml，可以据此来计算核酸样品的浓度。 DNA浓度计算：根据经验数据，若OD260=l时，dsDNA的浓度为50微克/毫升，假如质粒样品pBR322稀释500倍，测得光吸收值为0.025，则该样品pBR322浓度为50*0.025*500=625微克/毫升。 分光光度法不但能确定核酸的浓度，还可通过测定在260nm和280nm的OD值的比值（OD260/OD280）估计核酸的纯度。纯净DNA的比值为1.8，纯净RNA的比值为2.0。若DNA的比值高于1.8，说明DNA样品中的RNA尚未除尽，若样品中含有酚和蛋白质将导致比值降低，此时，可通过苯酚-氯仿-异戊醇方法抽提后再检测，以排除蛋白质的影响。270nm存在高吸收表明有酚的干扰。 优点：使用UⅤ-240紫外分光光度计测定DNA的方法简便、快速。 注意的问题： 1）用UⅤ-240可以通过260 nm和280 nm的OD值的比值（OD260/OD280）估计核酸的浓度和纯度，但不能区分DNA的超螺旋、开环、线状三种构型，也不能区分染色体DNA。由于测定OD260时，难于排除RNA，染色体DNA，以及DNA解链的增色效应等因素，因此测得的数据往往比实际浓度偏高。 2）用UⅤ-240，有因样品槽大，测定用量较多的缺点，但对于测浓度较高的样品，特别是测定寡聚核苷酸的浓度其效果甚佳。其他DNA多数选用琼脂糖凝胶法进行鉴定。 3）紫外分光光度法只能用于测定浓度大于0.25 ug/ml的核酸溶液，对浓度更小的样品，可采用荧光分光光度法。 溴化乙锭-标准DNA浓度比较法测定DNA浓度 DNA本身不产生荧光，但荧光染料溴化乙锭(EB)嵌入碱基对之间后，可在紫外线激发下发出红色荧光。不同浓度的DNA溶于一定浓度的溴化乙锭溶液中，在紫外灯下所发射荧光的强度与核酸含量成正比，使用一系列已知浓度的DNA溶液作标准对照，可比较出被测DNA样品的浓度。 特点：仪器设备与操作都很简单，省时，配制一套标准浓度的DNA样品与试剂存于-20℃，随时可进行测定比较。克服了UⅤ-240用量大的缺点，只需l ul的用量，就可测出l ng的DNA样品。适合于测定经过分离纯化后的DNA片段浓度，为DNA的重组连接提供浓度参数。 在基因操作中，对于DNA含量较少，特别是要对分离纯化后的DNA片段的浓度进行测定，用此比较法最为合适。此法直接简便，测定量仅需0.5~1微升就能比较出确切浓度，灵敏度可达l~5ng。 影响实验结果的因素： 1）本实验对样品中含有的染色体DNA、RNA以及质粒DNA的三种构型无法区分；若待测样品不纯，测得的浓度比实际浓度肯定偏高。 2）实验采用比较法，操作者的目测误差也影响准确性。 3）DNA浓度大于20ng/ul以上时浓度误差较大，需要样品稀释到合适的浓度才能进行比较。 DNA的凝胶电泳 带电物质在电场中向相反电极移动的现象称为电泳(electrophoresis)。各种生物大分子在一定pH条件下，可以解离成带电荷的离子，在电场中会向相反的电极移动。电泳技术是l9世纪初发明的，人们采用各种材料作为支持电泳介质，其中以琼脂糖和聚丙烯酰胺为支持介质的凝胶电泳最为突出。 凝胶电泳的原理比较筒单。当一种分子被放置在电场当中时，它们就会以一定的速度移向适当的电极。这种电泳分子在电场作用下的迁移速度，叫做电泳的迁移率，它同电场的强度和电泳分子本身所携带的净电荷数成正比。即电场强度越大，电泳分子所携带的净电荷数量越多，其迁移的速度也就越快，反之则较慢。由于在电泳中使用了一种无反应活性的稳定的支持介质，如琼脂糖凝胶和聚丙烯酞胺凝胶等，电泳的迁移率又是同分子的摩擦系数成反比的。已知摩擦系数是分子的大小、极性及介质黏度的函数，因此根据分子大小的不同、构型或形状的差异，以及所带的净电荷的多寡，便可以通过电泳将蛋白质或核酸分子混合物中的各种成分彼此分离开来。 应用凝胶电泳技木分离DNA片段的基本原理：在一定生理条件下，核酸分子之糖-磷酸骨架中的磷酸基团是呈离子化状态的，DNA和RNA的多核苷酸链可叫做多聚阴离子，核酸分子在电场中向正电极方向迁移。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷