基因枪转化介绍.pptVIP

* * 基因枪介导法转化 基因枪技术是一种将核酸直接发送至细胞内的物理学方法。PDS-1000/H台式基因枪可以实现对细胞的原位转导；应用于包括培养细胞、组织、器官、植物、动物、细菌和细胞器官等各种不同的目标；目标区域：大（40c㎡）；压力范围：450-2,200psi；目标类型：动物；细胞和器官培养植物；小的整体植株，培养细胞和外植体真菌，细菌和其他微生物细胞器官，叶绿体，线粒体。 PDS-1000/H台式基因枪 基因枪介导转化法 原理： 利用火药爆炸或高压气体加速（这一加速设备被称为基因枪），将包裹了带目的基因的DNA溶液的高速微弹直接送入完整的植物组织和细胞中，然后通过细胞和组织培养技术，再生出植株，选出其中转基因阳性植株即为转基因植株。 与农杆菌转化相比，基因枪法转化的一个主要优点是不受受体植物范围的限制。而且其载体质粒的构建也相对简单，因此也是目前转基因研究中应用较为广泛的一种方法。 可裂膜（压力选择膜） 高压气体 挡网---阻挡可裂膜及载膜的碎片 培养皿 受体组织 子弹载膜 子弹 基因枪介导法转化： 材料： 　　目的基因： 受体组织（愈伤组织，茎尖组织，叶片组织等离体及活 体组织）， 基因枪轰击金粉（钨粉）包埋试剂盒 　　 试剂 　　系列培养基： 1、常规培养基：愈伤诱导培养基，增殖培养基， 分化培养基，筛选培养基，生根培养基 2、高渗培养基：愈伤诱导培养基或继代培养基中加入 0.1-0.3 mol/l的甘露醇和山梨醇（提高渗透压）。 3、筛选培养基，与各自基因及载体相关。 受体材料的准备 转化基因的准备 不同的转化方法 转化后的材料的处理 操作步骤 一、受体材料的预处理 洋葱表皮细胞的准备： 将洋葱剥掉4-5层葱片，将靠近心部的葱片切成1 .5 cmΧ1 .5 cm左右的小快，小心撕取内表皮，置于MS固体培养基上25℃暗培养过夜。 水稻： 在基因枪轰击枪前先将材料转入高渗培养基中预先培养4-6个小时（9 cm的培养皿） 二、微弹载体的制备 1．金粉或钨粉悬浮液的制备 （1）称取6 mg金粉或钨粉于1.5ml离心管中，加入1 ml无水酒精，充分涡旋（Votex）1-2 min，然后静止数分钟，10 000 r/min 离心10 sec； （2）小心去除上清夜，加入1 ml无菌水，充分涡旋（Votex）1-2 min，然后静止数分钟，10 000 r/min 1离心0 sec； （3）重复步骤2次；（4）小心去除上清夜，加入100 μl无菌水，待用。 2．DNA包埋 （1） 取50 μl悬浮好的悬浮液1.5ml于离心管中置于涡旋器上缓慢涡旋， 同时加入5 μg DNA; （2） 加入20 μl新鲜配置的0.1 M亚精胺，缓慢涡旋； （3） 一滴一滴 加入50 μl 2.5 M的CaCl2，缓慢涡旋； （4） 室温放置10 min，12 000 r/min离心10 sec； （5） 小心去处上清夜，加入60 μl无水酒精，缓慢涡旋，待用。 多胺在适宜的pH条件下，以多聚阳离子态存在，易和带负电荷的核酸和蛋白质结合，即多胺上的氨基和亚氨基与核酸的磷酸基结合，稳定了核酸的二级结构，有助于DNA的复制。 CaCl2使DNA慢慢聚集（沉淀）在金粉（钨粉）周围。 三、装弹（BiolisticR PDS-1000/He BIO-RAD） 将台式基因枪放置于一个较大型的超净工作台上，以便于无菌操作； （1）用70-75%的酒精擦净真空室及表面； （2）用75%酒精浸泡消毒可裂膜、子弹载膜，并用无菌滤纸吸干； （3）用100%的酒精浸泡阻挡网和子弹载膜器，并用明火烧干； （4）打开电源开关、真空泵及氦气瓶阀； （5）将子弹载膜置于子弹载膜器上，吸10μl DNA-金属包埋悬浮液 （充分悬浮）涂布于子弹载膜中间，于工作台上吹干； （6）将可裂膜装入固定盖，旋紧； （7）将阻挡网和载有子弹载膜的子弹载膜器装入微粒子弹发射装置中； （8）将欲转化的靶组织放入轰击箱内，待轰击。 四、轰击 （1）抽真空：按VAC（vaccum）键，当真空度达到需要值 （25-27 inches Hg）时，将VAC键转到HOLD位置； （2）轰击：按FIRE键直到可裂膜爆破，再桉VENT键放气，取出样品， 完成轰击。 五、恢复培养 将轰击后的材料在高渗培养基中培养过夜，然后继代到不含抗生素的继代培养基中恢复1-2周，以利于受轰击细胞的恢复及外源基因的表达。