电化学发光免疫法教程方案.ppt

* * 链霉亲和素（streptoavidin，SA）和生物素（biotin，B）一分子SA可与4分子B相结合。在ELECSYS的试剂中，SA通过特殊的蛋白结合物均匀牢固地包被在磁性微粒上，形成通用的能与B结合的固相载体。另一试剂为与经活化的B衍生物化合的抗原或抗体。两种试剂混合时，抗原或抗体即包被在磁性微粒上。 * * * 甲状腺激素，甲肝，乙肝，已成为一种重要的非同位素标记免疫分析方法，用于各种抗原、半抗原、抗体、激素、酶、脂肪酸、维生素和药物等的检测。 ECLIA检测流程图四 （电极充电启动电化学反应） ECLIA检测流程图五 （撤消磁场冲洗磁珠） 方法评价 采用的固相载体是带有磁性的直径约2.8 μm的聚苯乙烯微粒。其特点是反应面积比板式扩大20－30倍，吸附效率高；在液体中形成均匀的悬液，参与反应时类似液相，反应速度大大加快； 方法评价 “链霉亲和素-生物素”是是具有很强的非共价相互作用的一对化合物，具有牢固而特异的结合，应用此放大系统，使检测的灵敏度大大提高； 方法评价 利用氧化铁的磁性，使用电磁场分离结合态和游离态，方便迅速，实现了精确的全自动化； 标记物的再循环利用，使发光时间更长、强度更高、易于测定。 ELIA优越性 高度敏感，可达pg／ml或pmol水平； 特异性强，重复性好，CV＜5％。 测定范围宽，可达7个数量级。 试剂稳定，无毒害，无污染，有效期长，达数月甚至数年。 操作简单，耗时短，易于自动化。 在对环保很重视的国家，CLIA成了取代RIA的首选方法。 临床应用 激素 肿瘤标记物 内分泌功能 传染性疾病 其它 如VB12、叶酸、铁蛋白、肌钙蛋白、肌红蛋白、酶、脂肪酸、维生素和药物等多种检测项目。 * * 常用的标记物包括荧光素、酶和放射性核素等，用这3种标记物进行标记的免疫检测技术被称为3大免疫标记技术。 * 我国放射免疫分析法有很高的灵敏度，但存在着放射性防护和同位素污染等问题。 * 一种物质由电子激发态回复到基态时，释放出的能量表现为光的发射。 * * 化学发光的物质有两种能态，即基态和激发态，前者能级低后者能级很高，一般地说在激发态时分子有很高并且不稳定的能量，它们很容易释放能量重新回到基态，当能量以光子形式释放时，我们就看到了生物发光。 * * 化学发光技术是近二、三十年来发展起来的一种测定方式 * 因此，如同RIA、FIA等一样利用免疫反应的特异性和化学发光本身的信号特异性形成了化学发光免疫测定（CLIA）技术。 * CLIA是继酶免技术（EIA）、放免技术（RIA）、荧光免疫技术（FIA）和时间分辨荧光免疫技术（TRFIA）之后发展的一项新兴测定技术。 * 微粒子化学发光免疫分析（ECIA） 也是一种酶免疫分析，用磁珠作为固相载体，增加反应体积和分离效率。标记的酶多为ALP。 * 化学发光酶免疫分析（CLEIA） 以催化反应的酶为标记物，抗原抗体结合后，其中的酶可对发光体系产生催化作用，产生发光效应。发光信号与抗原抗体的量成正比。多用的发光体系是HRP-鲁米诺。 化学发光免疫分析（CLIA） 是一种用发光剂直接标记抗体的一类免疫分析法，用来标记的发光物必须能参与发光反应、标记和偶联后能稳定、理化性质和免疫特性不改变，多用吖啶酯类和苯酚类化合物。 * 它是一种在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应，实际上包括了电化学和化学发光二个过程。 * 它如同酶免疫测定中的底物， 配入缓冲液中， 是ECLI反应中的电子供体。 * * * 发光剂 [Ru(bpy)3]2+和电子供体TPA在阳极表面可同时各失去一个电子而发生氧化反应，使二价的[Ru(bpy)3]2+被氧化成三价，后者是一种强氧化剂；另一方面，TPA 被氧化成阳离子自由基TPA+●，后者很不稳定，可自发失去一个质子（H+），形成自由基TPA●，这是一种很强的还原剂，可将一个电子给三价的[Ru(bpy)3]3+，使其形成激发态的[Ru(bpy)3]2+，而TPA自身被氧化成二丙胺和丙醛。激发态的[Ru(bpy)3]2+通过荧光机制衰减，发射出一个波长620nm的光子，重新生成基态的[Ru(bpy)3]2+。该过程在电极表面周而复始地进行，产生许多光子，光电倍增管检测光强度，光强度与[Ru(bpy)3]2+的浓度呈线性关系,故可测出待测抗原的含量。发光标记物不被消耗，可以循环发光，这一过程在电极表面周而复始地进行，产生许多光子，使光信号得以增强。 * 酶免技术（EIA）、放免技术（RIA）、荧光免疫技术（FIA）、时间分辨荧光免疫技术（TRFIA） 一种在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应，实际上包括了电化学和化学发光二个过程,其中应用了“亲和素-生物素”放大系统，使检测的