第四章基因操作的技术原理(电泳)技术分析.ppt

4.1核酸的凝胶电泳 1 定义： 用琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳等作为支持介质的区带电泳法称为凝胶电泳。 琼脂糖凝胶电泳 适用于分离大分子核酸。 聚丙烯酰胺凝胶电泳 普遍用于分离蛋白质及 较小分子质量的核酸 （1） 缓冲液： 常用的几种电泳缓冲液有： TAE[Tris-乙酸和EDTA (pH8.0)] TBE(Tris-硼酸和EDTA) TPE(Tris-磷酸和EDTA) 一般配制成浓缩母液（10X或5X）,储于室温。 TAE、TBE和TPE比较 （4） 电泳条件 在低电压时,线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加,不同分子量的DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长,片段越大,因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大,因此电压增加,琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。 大片断低电压长时间 小片段高电压短时间 （5） 染色和观察： 溴化乙锭（ethidium bromide,EB）染色， 溴化乙锭用于检测琼脂糖凝胶中的DNA,染料会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状DNA,使其刚性更强。 1 常用的核酸染色剂是溴化乙锭（EB）， 染色效果好， 操作方便，但是稳定性差， 具有毒性，致癌作用。 2 SYBR?Green ， GelRed 毒性小，但价格贵。 3 GeneGreen 相比则是性价比高的低毒 替代染料，其灵敏度比传统EB染料高10 倍以上。 琼脂糖凝胶电泳的操作步骤 　 1.????根据欲分离DNA片段大小用配制适宜浓度琼脂糖溶液：应准确称量琼脂糖干粉加到盛有定好量的电泳缓冲液的三角烧瓶或玻璃瓶中。缓冲液体积应小于容器容积的50%。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。 2 待熔化的凝胶稍冷却后加入溴化乙锭（枪头沾取少许即可）。轻轻地旋转以充分混匀凝胶溶液。 3.???琼脂糖溶液正在冷却时，用一个合适的梳子形成加样孔。梳齿的位置在托盘底面上0.5～1.0mm，这样琼脂糖浇灌到托盘时将形成符合要求的加样孔。 4.?????浇灌温热的琼脂糖溶液进入模具。凝胶适宜厚度为3～5mm。 5.????让凝胶溶液完全凝结，室温下20-30min。 小心拔出梳子。将凝胶安放到电泳槽内。向电泳槽加入电泳缓冲液 。 6.? 混合DNA样品和0.2倍体积6×指示剂。 7.? 用微量移液器将样品混合液缓慢加至浸没凝胶的加样孔内。分子质量标准应分别加至样品孔的左侧和右侧的两个孔内。 8.? 关上电泳槽盖，接好电极插头。给予合适的电压。 9.? 当DNA样品或染料在凝胶中迁移了足够距离时，关上电源、拔出电极插头和打开电泳槽盖. 10. 转移凝胶至凝胶成像系统内观察。 /v/b1602802407.html 二 聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，简称PAGE）是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的电泳方法 PAGE应用广泛，可用于蛋白质、酶、核酸等生物分子的分离、定性、定量及少量的制备，还可测定分子量、等电点等 蛋白分子量与聚丙烯酰胺凝胶浓度对应关系 SDS电泳凝胶中各主要成分的作用 聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺是为蛋白质电泳提供载体， 其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否， 与促凝剂及环境密切相关； 制胶缓冲液：浓缩胶选择pH6.7，分离胶选择pH8.9， 选择Tris-HCL系统。 TEMED与AP(催化剂)：促凝作用，加速聚丙烯酰胺的凝固。 十二烷基磺酸钠（SDS）：阳离子去污剂，作用有四：去蛋白 质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白 分子内的疏水作用、去多肽折叠。 * * 第四章 基因工程的主要技术原理 2 基本原理 带有负电荷的DNA或RNA核苷酸链，依靠无反应活性的稳定的支持介质和缓冲液，在电场中以一定的迁移率从负极移向正极。 根据核酸分子大小不同、构型或形状的差异，以及所带电荷的不同，可以通过电泳将核酸分子混合物中的各种成分彼此分