流式结果分析JSS.pptVIP

流式结果分析 流式原理 流式细胞仪通常以激光作为发光源。经过聚焦整形后的光束，垂直照射在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下，产生散射光和激发荧光。这两种信号同时被前向光电二极管和90°方向的光电倍增管接收。光散射信号在前向小角度进行检测，这种信号基本上反映了细胞体积的大小；荧光信号的接受方向与激光束垂直，经过一系列双色性反射镜和带通滤光片的分离，形成多个不同波长的荧光信号。 流式原理 流式常用细胞特征 细胞组成 细胞功能 大小 细胞表面/胞浆/核--特异性抗原 粒度 细胞活性 DNA, RNA含量 胞内细胞因子 蛋白质含量 激素结合位点 钙离子, PH值, 膜电位 酶活性 流式常用实验 1、细胞凋亡 2、细胞周期测定 3、膜电位检测 4、表面分子测定 流式检测细胞凋亡 磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于细胞膜的内侧，但在细胞 凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。 Annexin-V是一种分子量为35~36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS 高亲和力特异性结合。将Annexin-V进行荧光素（FITC、PE）或biotin标记， 以标记了的Annexin-V作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细 胞凋亡的发生。 　　碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细 胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。 因此将Annexin-V与PI匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区 分开来。 流式检测细胞凋亡 常用检测试剂盒：FITC-PI(常见细胞) PE-ADD（绿色荧光的细胞） 流式检测细胞凋亡 流式检测细胞周期 PI为非膜通透性染料，不能染活细胞。在流式染色时 通过Triton等的作用，进入细胞与DNA结合而发出荧光， 通过检测颗粒中荧光强度测得相对DNA含量，根据细胞 在不同周期中DNA含量的不同，将细胞分为不同的周期。 破膜的方法：1、triton打孔 2、70%乙醇固定 3、低渗法 （比较简单） 流式检测细胞周期 表面标志物、蛋白等 将所要检测的蛋白用带有荧光标记的一抗 孵育后，蛋白就会带上相应的荧光，之后用 流式检测荧光值，便可得到表达情况 表面标志物——以CD44为例 线粒体膜电位的检测 线粒体在细胞凋亡的过程中起着枢纽作用，线粒体跨膜电 位的下降，被认为是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事 件，它发生在细胞核凋亡特征（染色质浓缩、DNA断裂）出 现之前，一旦线粒体DYmt崩溃，则细胞凋亡不可逆转。 　　线粒体跨膜电位的存在，使一些亲脂性阳离子荧光染料 如DiOC6、JC-1、TMRM等可结合到线粒体基质，其荧光 的增强或减弱说明线粒体内膜电负性的增高或降低。 JC-1检测原理 JC-1有单体和多聚体两种存在状态，低浓度时，以单体 存在，可检测到绿色荧光，用流式检测时，通常为FL-1通道 (和FITC同通道）高浓度时，以多聚体存在，可检测到红光， 流式检测通常为FL-2通道（和PE同通道)。因JC-1浓度的 变化,在单体和多聚体之间形成一个可逆的转变过程。 正常细胞，膜电位正常时，JC-1通过线粒体膜极性进入 线粒体内，并因浓度升高而形成发射红色荧光的多聚体，而 凋亡细胞，线粒体跨膜电位去极化，JC-1从线粒体内释放， 浓度降低，逆转为发射绿色荧光的单体形式。故而可以通过 检测绿色和红色荧光来定性(细胞群的偏移）定量（细胞群 的荧光强度）的检测线粒体膜电位的变化 流式原理 流式原理 Thank you ！