第七章等电聚焦电泳技术.pptVIP

第六章、等电聚焦电泳技术 一、基本原理 （1）天然pH梯度的形成：这种梯度是由电流本身所引起并保持的。若将一些两性电解质放入电泳槽中，则它们在阳极的酸性介质中就会得到质子而带正电，在阴极的碱性介质中则失掉质子而带负电，这样带电粒子就会受其附近的电极所排斥而向相反方向移动。设一个酸性最强的两性电解质（甲），当它由阴极逐渐接近阳极时，就会失去电荷而停止运动，（甲）所在的位置就是它的等电点；另有一个等电点稍高于（甲）的物质（乙)，在向阳极运动时，它只能排在（甲）的阴极侧。假如有很多不同等电点的两性电解质，它们将按照等电点从阳极向阴极由低到高的顺序依次排列，形成一个平稳的pH梯度。在防止对流的情况下，只要电流稳定，这个pH梯度将保持不变。 （2）蛋白质的电聚焦分离：蛋白质及多肽是两性电解质，它们在等电点附近仍有电荷而能进行电迁移，在等电点时就失去电荷而停止运动。在有第三种居间的两性电解质存在时可将两种蛋白质完全分开。 等电聚焦的优点： 有很高的分辨率，可将等电点相差0.01-0.02 pH单位的蛋白质分开； 电聚焦的分辨率是指能够测定出的两个临近蛋白带的最小pH差，以?(pI)表示： 电聚焦能抵消扩散作用，使区带越走越窄； 可直接测出蛋白质的等电点，其精确度可达0.01 pH单位。 电聚焦技术的缺点： 电聚焦要求用无盐溶液，而在无盐溶液中某些蛋白质可能发生沉淀； 不适用在等电点不溶或发生变性的蛋白质。 二、载体两性电解质 稳定的pH梯度是等电聚焦技术的关键； 特殊的两性电解质可以实现pH梯度。 两性电解质：同时带有正、负电基团的化合物。 1. 载体两性电解质必需具备的条件 （4）不同pH值的载体要有相同的电导系数； （5）分子量要小； （6）化学组成应不同于被分离物质，无紫外吸收或吸收较低，不干扰测定； （7）不与分离物质反应或使之变性。 总起来说，当一个两性电解质的等电点介于两个很近的pk值之间时，它在等电点的解离度大，缓冲能力强，而且电导系数高，这就是好的载体两性电解质。 2. 等电聚焦中使用的载体两性电解质 等电聚焦中使用的载体两性电解质是含有正负电基团的一类异构体与同系物的混合物。其化学本质是多羧基、多氨基脂肪族化合物。 载体两性电解质是由具有几个pH值很相近的多乙烯多胺（如五乙烯六胺），与不饱和酸（如丙烯酸）发生加合反应而进行合成的。调节胺和酸的比例可以合成出多异构物和同系物，以保证很多具有不同而又互相接近的pK值和pI值，从而得到平滑的pH梯度。 常用的载体两性电解质： 载体两性电解质的等电点在pH3-10的范围，分子量在300-1000之间，电导性能良好，可以使电场强度分布较均匀，它们的水溶性良好，在1%水溶液中的紫外吸收值（260 nm）很低。 3. pH梯度的形成 在不加电场时，载体两性电解质溶液的pH值大约是该溶液pH范围的平均值。 当加入电场后，载体两性电解质根据各自的pI值进行分布，低pI的分子向阳极移动，高pI值的分子向阴极移动，直至各自的等电点而停止运动，从而形成pH梯度。 相邻两种分子的两性载体电解质形成的不同pH的等电点层，每一层由于它们的高缓冲能力给予环境一个pH值。两层之间不能形成纯水层，中间部分相互粘连，从而形成平稳的pH梯度。 4. pH梯度形成的时间效应 pH梯度的形成有一时间过程：加入电场后，pH梯度首先在电极两端开始形成，然后移向中间。 在12 cm的凝胶距离中，使用30 W的功率，Ampholine在1 h后，pH梯度才能完全形成，2 h 后变化很小。 5. TEMED对pH梯度的影响 载体两性电解质本身可以作为凝胶聚合的促进剂，因此在凝胶制备中可以不加TEMED； 如加入TEMED，可促使广泛、中性和碱性范围载体两性电解质凝胶的聚合，对酸性范围无加速作用； TEMED的存在可增加聚丙烯酰胺凝胶pH梯度碱性侧的pH（扩展1－2 pH单位）。由于CO2的影响，碱性侧的pH往往达不到指定的pH值，因此TEMED的扩展具有实际意义。 三、等电点聚焦中稳定介质的选择 稳定介质是用以防止液体对流保持pH梯度，避免已分离物质再混合的重要措施。 （一）密度梯度 密度梯度是由重溶液和轻溶液以梯度混合形成。用做密度梯度的溶质应具有以下条件：溶解度高，粘度低；密度大，得到的密度差不低于0.12 g/cm3，不与样品蛋白质起反应，不解离。最常用的是蔗糖（分析纯）。重溶液含蔗糖50%（W/V)，这时柱上和柱下最大密度差为0.2 g/cm3。蔗糖在高pH值时会分解，影响pH梯度及pI值测定，这种情况下可改用甘油，也可用甘露醇，山梨醇，右旋糖酐等。 （二）固相支持介质 聚丙烯酰胺凝胶 浓度：5－8％； 交联度：3％ 琼脂糖凝胶 浓度：1％ 固相