環境與生命學院化學分析技術實驗教學手冊.docVIP

環境與生命學院化學分析技術 實驗教學手冊儀器名稱: 高效能液相層析儀 組別:第三組 組員:梁弘憲4CM1010031(組長) 方鈺評4CM1010012 徐珮慈4CM1010009 麥浩儀4CM1010053 翁健鈞4CM1010035 指導教授:王昭凱前言: 高效能液相層析技術 (High Performance Liquid Chromatography HPLC) 為分析技術中應用最廣泛的一種分離方法，可用於定性與定量分 析樣品中的有機物質。是製藥、食品、美容等工業常用的品管儀器。貳、實驗目的: 1. 了解高效能液相分析儀分析之原理。2. 學習到如何操作使用高效能液相層析儀，並且熟悉儀器之操作使用。3. 了解糖精與胺基酸之分析方法。4. 應用液相層析之原理計算分析樣品之濃度與性質。5. 熟練高效能液相層析儀之操作過程，以及實驗過程所有安全事項。參、儀器構造: 肆、實驗原理: 層析系統最為重要的兩組成為:一、固定相 (stationary phase)- 分離管柱;二、流動相 (mobile phase) -溶劑。 層析分離過程，主要由不同物質，在兩個不相溶的媒介 (亦即固定 相及流動相 ) 之間的平衡分佈差異而定。欲分離的成份需先溶於溶劑 中，然後在高壓下注入分離管柱，樣品中的各個成份藉由移動相的帶 動，滲透通過分離管柱中的固定相。各成份的移度依其平衡分佈狀態而 定，有些成份和固定相之間的作用力不大，很快地被沖堤出分離管柱， 而有些成份與固定相作用力較快，則較慢沖堤出來。也可說明為此兩者各有不同之極性或非極性強度;樣品分子因本身 極性之強弱，與此兩相 ( 固定相、流動相 ) 親和力不為相同，與固定 相親和力大者，較易停留滯原地;與流動相親和力大者，較易隨流動相 移動，就是因為如此，才達到分離之目的。實驗技術中以分離柱效率與 溶劑之效率為關鍵指標分離柱效率實驗時要先考慮液體通過管柱時偵測圖之尖鋒寬度程度，再來決定 分離柱之設計以及操作條件。分離柱之效率可以使用理論板數 (N) 或 者理論板等值高度 (EETP) 來為定量說明。就一般來說，分離柱親合樣 品量與流出樣品量應相等，如此一來分離效果最佳。如要比較不同分離 柱效率或者是不同條件時，可用 HETP 值作為比較。 (L) 是分離柱之 長度， N 值數目越多 HETP 值越小，效率則越高。 理論板數 (N) 之定義如下表 : 二、溶劑之效率溶劑效率來自於溶質以及溶劑之間的作用力，決定試料中各種成分 在圖譜中的相對位置，而且可以因為作用力的不同而觀察到混合物分離 之現象。 伍、實驗器材及樣品: 1. 高效液相層析儀( 需含電腦一台與印表機 ) 。2. 4 位數精密天枰。3. 1000 毫升燒杯、 1000 毫升量瓶、稱量紙。4. 氣泡去除閥。5. Sacchanin( 糖精 ) 。 6. 胺基酸。7. 正乙院 (n-Hexane) 。8. 異丙醇 (Isopropyl alcohol) 。9. 甲醇。 藥品 MSDS 請參閱附件二。陸、實驗步驟: 一、樣品配置: 1. 取胺基酸 lO mg 溶於 l00 ml 的甲醇中，約為 l00 ppm。 2. 取胺基酸 2.3 mg 溶於 3 ml 的異丙醇中，約為 766.7 ppm。 3. 取糖精 2.5 mg 溶於 4 ml 的異丙醇中，約為 625 ppm。 4. 胺基酸衍生化，先取 0.O0l mol 的三聚氯化物加入溶液中，攪拌 1 小時後加入 HCl 直到大量沉澱，過濾並用大量純水沖洗，將濾餅乾燥，取 2.5mg 的胺基酸衍生 物溶於 1O ml 水中(如胺基酸衍生物不易溶解，可用微量的碳酸鈉調整 pH 值約為 8.0)約為 25O ppm。二、儀器操作步驟 : 13.點選監測鈕後會跳出選擇參數畫面，參數通常不變的。(在這的參數指的是環境參數) 19.當關閉幫浦後就可以關閉視窗20.關閉 HPLC 軟體。 21.關閉 HPLC 介面連結器電源。22.關閉幫浦電源。 23.關閉偵測器電源。24.關閉電腦主機、螢幕及印表機電源。 三、維護保養與注意事項: 1、切勿分析高分子物質以免管柱阻塞。 2、每周以流動相清潔分離管柱與管路一次。3、每季檢查分離管柱的效能。4、每年檢查幫浦與偵測器的效能。柒.實驗結果: (第二次) 捌、實驗討論: