凝胶阻滞,EMSA课件.ppt

凝 胶 阻 滞Electro Mobility Shift Assay，EMSAGel Shift Assay 实验原理 在Gel-shift experiment实验中，首先是用32P标记待测的DNA片段（probe），然后同细胞蛋白质提取物一起温育，于是使有可能形成DNA-蛋白质复合物。将它加样到非变性的PAGE中，在控制使蛋白质仍与DNA保持结合状态的条件下进行电泳分离，并运用放射自显影技术显现具放射性标记的DNA条带位置。如果细胞蛋白提取物中不存在可与32P标记的探针DNA结合的蛋白质，那么所有的32P都将集中在凝胶底部；反之，将会形成DNA-蛋白质复合物，由于凝胶阻滞的原因，其特有的32P标记的探针DNA条带都将滞后出现在较靠近凝胶顶部的位置。 EMSA: Principle 实验操作步骤 1、实验前准备2、形成蛋白-探针复合物 3、制备凝胶，电泳 4、转膜 5、检测 注意事项 1、实验前准备（1）合理的实验方案根据研究目的合理设计特异性探针实验组以及非特异性探针对照组，如有必要还可以添加特异性抗体组、特异性核酸竞争组等。（2）样本制备可以选择提取样本的总蛋白、核蛋白或者使用纯化好的目的蛋白。对样本蛋白进行定量，实验中等量加入蛋白。（3）探针制备 2、检测（1）去除转好的膜，放入合适的盛有缓冲液的容器中，冲洗,注意整个检测过程避免