实验三SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量2014.10.08技巧.ppt

六　染色和脱色 染色 用一块胶，另一块胶用于转膜。 加入染色液，染色45分钟。 脱色 染色完毕，倾出染色液，加入脱色液。20～30min换一次脱色液，2～3次后可初步观察电泳条带，然后脱色过夜，直至背景清晰。 七、 Mr的计算 标难曲线只对同一块凝胶上的样品的分子量测定才具有可靠性。 以每个蛋白标准的分子量对数对它的相对迁移率作图得标准曲线，量出未知蛋白的迁移率即可测出其分于量。 八　转膜 胶放在3张缓冲液浸湿的滤纸上，盖上经甲醇激活（15-30sec）的PVDF膜（切多余的膜及纸，与凝胶一样大小）排气泡，盖同样3张缓冲液浸湿的滤纸，排气泡。 顺序： 负极－ 3层滤纸－凝胶－膜－ 3层滤纸－正极，如图。 用塑料夹夹紧，放入转移电泳仪，电泳槽搁置冰上，恒压１小时。丽春红染色1分钟检测目标蛋白。 九　封闭 PVDF膜用TBST淋洗，放入封闭液中 蛋白转膜组装顺序（sandwich制作） 组装顺序： 转膜夹黑色面（负极）－海绵垫－滤纸－胶－ 膜 －滤纸－海绵垫－红色面（正极） 海绵 Cathode _ Anode + 滤纸 膜 胶 滤纸 海绵 醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质 【基本原理】 本实验用醋酸纤维薄膜作电泳支持物分离血清蛋白质。血清蛋白质的等电点都小于7.5，在pH=8.