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VB12发酵工艺研究 [摘要]通过研究甜菜碱的不同加量对脱氮假单胞杆菌发酵生产VB12的影响，结果发现甜菜碱的减量能够提高VB12发酵单位，在此基础上又进行了发酵培养基中甜菜碱加量对VB12发酵单位的影响，结果发现发酵培养基中甜菜碱有7g/L降到4g/L时，对VB12发酵单位无显著性影响，在补料中，甜菜碱的减量有30g/L降低到15g/L时，对VB12发酵单位无显著性影响。因此，在不影响VB12产量前提下，可以通过甜菜碱的减量达到节约成本，提高经济效益的目的。 [关键词]甜菜碱，发酵培养基，发酵工艺 预计未来若干年内，国际上对添加各种维生素的食品的需求仍将不断增加。作为OTC药品的多种维生素制剂产品在国外的应用已相当普遍，今后市场需求还会增加。另外，由于欧、美等发达国家受到“疯牛病”事件的影响，现在欧洲、北美以及亚洲的日、韩等国的饲养场都已采用人工生产的各种维生素作为饲料添加剂，不用危险的“肉骨粉”。这些因素使得国际市场对维生素B12的需求在未来一段时间里将保持持续增长。因此，通过研究VB12的发酵工艺，提高VB12的产量和质量具有重要的意义，本文通过探讨甜菜碱不同加量对VB12发酵单位的影响，以期达到降低原材料加入量，提高经济效益的目的。 1材料与方法 1.1材料 菌种为脱氮假单胞杆菌，种子培养基组成：70g/L甜菜糖蜜+2g/L硫酸铵+1.5g/L硫酸镁+1.5g/L硫酸锌+0.02g/L硫酸锰+0.02g/L硝酸钴，调节pH 7.0；发酵培养基组成为150g/L的甜菜糖蜜+15g/L蔗糖+3.5g/L氯化胆碱+7g/L甜菜碱+0.15g/L硫酸镁+0.07g/L硫酸铵+1.5g/L硝酸钴+0.15g/L硫酸锌+0.9g/L氧化镁+1g/L甘油，调节pH 7.0，补料组成为：175g/L甜菜糖蜜+150g/L蔗糖+30g/L甜菜碱+0.5g/L二甲基苯并咪唑，调节pH 7.0。 1.2发酵方法 首先用无菌水刮洗斜面的菌体制备菌悬液，取2毫升液体接入装有30mL种子培养基的三角瓶（规格为300mL）中，在28℃条件下，以每分钟200转的速度震荡培养，直到菌体吸光度值为0.2。摇瓶培养方法为：在三角瓶（规格为300mL）中装入培养基35mL，接种10%，在32摄氏度条件下，放置在旋转式摇床中培养一周（转速设置为200r/min）。 1.3采集数据方法 对菌体浓度的测量采用吸光度法（取2mL的待测样品稀释定容至100mL后测量吸光度），对VB12发酵单位的测量采用高效液相法：选用C18色谱柱，流动相为甲醇和水（28:100），设定检测波长为361nm，流速设置为1mL/min。 2结果 2.1发酵培养基中进行的甜菜碱减量实验结果：甜菜碱的减量对VB12发酵单位没有显著性影响；当甜菜碱的配比为4g/L时，随着甜菜碱量的继续降低，VB12的发酵单位随之降低，具体数据统计结果如下表1： 表1：发酵培养基中进行的甜菜碱减量实验数据统计结果 甜菜碱加量 （g/L） 发酵单位 （mg/L） 平均单位 （mg/L） 提高百分比 （%） 7.0 205.2 211.3 207.9 -- 207.7 6.0 208.6 210.8 210.4 0.95 211.2 5.0 210.7 211.0 209.9 0.95 208.4 4.5 210.0 210.1 209.5 0.50 207.6 4.0 208.1 208.0 207.5 0.00 207.2 2.2补料中甜菜碱减量实验结果：甜菜碱的减量对VB12发酵单位没有显著性影响；当甜菜碱的配比为10g/L时，随着甜菜碱量的继续降低，VB12的发酵单位随之降低。 由实验得出的结论是：甜菜碱的加量并不是越多越好，其具有一定的限度。 3讨论 自进入21世纪，我国饲料产量的增长速度十分惊人，十多年来平均每年增加的饲料数量就达到800多万吨。2000年，我国饲料产量为7500万吨，目前已达到18000万吨，成为世界最大的饲料生产国。以前，我国饲料添加剂中维生素B12的用量很少[1]，最近以来，这方面的用量在逐年大幅增长，今后市场还有很大的发展空间，今后，我国维生素B12产业要加快发展，应注意抓好以下几方面工作： 3.1加大科技投入，提高工艺技术 　　维生素B12的生产工艺繁琐，步骤多，耗时长，反应条件难以掌握，且成品见光易变质。因而质量较难控制，杂质较多，收率较低，成本较高。多年来影响我国维生素B12的生产和出口。最近以来，各生产企业纷纷加大了科技投入，工艺技术有了很大提高，产品产量和质量明显上升。 　　最近以来，我国科技人员在维生素B12的工艺改进、质量提高等许多方面都取得了不少进展，国家知识产权局颁发的发明专利就有多项。如冯胜利提出的中国发明专