实验十一质粒DNA的制备(精选).docVIP

教案首页 第 4 次课 授课时间：2006年11月20日～11月23日 课程名称 生物化学与分子生物学实验课 年级 2006 专业、层次 临床医学本科 授课教师 许成山 职称 课 型 大、小 小 学时 4 授课题目（章、节） 实验十一 质粒DNA的制备 基本教材或主要参考书 自编 《生物化学与分子生物学实验指导》 教学目的与要求： 1. 学习小规模制备质粒DNA的技术； 2. 掌握碱裂解法制备质粒DNA的原理； 3. 掌握高速离心机的基本操作及微量加样枪的使用。 大体内容与时间安排，教学方法： 1. 碱裂解法制备质粒DNA的原理及一些试剂的生化原理 10min 2. 碱裂解法制备质粒DNA的注意事项以及高速离心机的操作 5min 3. 学生做实验 145min 教学方法：实验+示教 教学重点、难点： 重点：1. 碱裂解法制备质粒DNA的原理 2. 碱裂解法中一些试剂的生化原理 3. 碱裂解法制备质粒DNA的注意事项 4. 高速离心机的操作步骤及注意事项 难点：碱裂解法中一些试剂的生化原理 教研室审阅意见： 教研室主任签名： 年 月 日 基本内容 辅助手段和时间分配 一、实验原理 （一）碱裂解法制备质粒DNA的原理： 1. 碱变性法抽提质粒是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。在pH12.6的高碱性条件下，染色体DNA和质粒DNA都发生变性，但质粒超螺旋共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离，所以当以pH4.8的KAc高盐缓冲液调节其pH至中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的构型，保存在溶液中。而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构。通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除,维持渗透压,防止DNA受机械剪切力而降解。②EDTA：螯合Mg2+,Ca2+,抑制DNase;有利于溶菌酶作用 低离子环境 。③Tris-HCL临用时加溶菌酶：溶菌,但pH 8.0该酶受抑制。 溶液Ⅱ：①NaOH：裂解胞壁及胞膜；核酸在pH5～9稳定,但在pH 12或 3则变性, 溶液II中pH为12.6, 可使染色体和质粒DNA变性。②SDS：离子型表面活性剂；能够溶解细胞壁上的脂质与蛋白；破坏细胞壁解聚胞中的核蛋白与蛋白质结合成复合物；使蛋白变性沉淀抑制RNase，下一步需除去。 溶液Ⅲ： KAc-HAc缓冲液 pH4.8 ：把pH12.6的抽提液调回pH至中性,使变性的质粒DNA复性,并稳定存在,而高盐的KAc有利于变性的染色体DNA、高分子量RNA、和K+-SDS-蛋白质-细胞壁复合物凝聚而沉淀。 二、操作步骤 三、注意事项以及高速离心机的操作 （一）注意事项 1. 注意分清哪一步弃上清，哪一步留上清。 2. 收集菌液离心后，弃上清，要使所有液体流出，否则可能导致DNA不被限制性内切酶切割。 3. 加入溶液Ⅰ时可用力振荡，而加入溶液Ⅱ5min后，如溶液不变粘稠 用移液嘴沾吸没有丝状物出现 ，则应终止实验。检查使用的试剂是否正确，加量是否正确。 4. 溶液Ⅰ和溶液Ⅲ要冰预冷，溶液Ⅱ要新鲜配制。 5. 加入溶液Ⅱ时禁止涡旋振荡（防止染色体DNA断裂），冰浴时间不能超过10min，否则破坏质粒DNA。 （二）高速离心机的使用 1. 操作步骤： 平衡（每管的体积及重量必须相等，使用天平时须无风操作）→插插头，开电源→对称放管→选择所需要的转数及离心时间→到时间后，待完全停止时取出离心管→关电源，拔插头。 2. 注意事项： （1）强调平衡的重要性（不仅损坏仪器，而且危及生命）。 （2）离心过程中如果听到特殊响声（连续高调尖叫声），应立即断开电源，停止离心，查找原因。 四、学生做实验 10min 5min 注意事项及操作 示教 145min 巡视、纠错、示范 小 结 1. 学生的操作情况（主要是微量加样枪和高速离心机的使用情况）。 2. 影响本次实验实验结果的关键因素。 复习思考题、作业题 1.加入溶液II时为何不能涡旋振荡？冰浴时间为何不能超过10min？ 2.加入溶液III后会产生大量的沉淀，试分析此沉淀的本质？ 3.加入2倍体积无水乙醇混匀，静置后无沉淀出现，说明了什么？ 下次课 预 习 要 点 DNA的限制性内切酶酶切分析的原理、操作过程及注意事项。 实 施 情况及 分 析 1