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生物技术专业核心课程 第二章 用于核酸操作的工具酶 第三章 用于基因克隆的载体 用于基因转移的受体菌或细胞 人造染色体载体 细菌人造染色体（Bacterial Artificial Chromosomes BAC） 细菌人造染色体通常是在大肠杆菌性因子F质粒的基础上 构建的，其装载量范围在50 - 300 kb之间 各种类型的pBACs在大肠杆菌受体菌只能维持单一拷贝 pBACs主要适用于： 克隆大型基因簇（gene cluster）结构 构建动植物基因文库 人造染色体载体 酵母人造染色体（Yeast Artificial Chromosomes YAC） YAC载体应含有下列元件： 酵母染色体的端粒序列 酵母人造染色体的构建： pYAC4 CEN4 EcoRI URA3 TEL BamHI TEL ori Apr TRP1 ARS1 酵母染色体的复制子 酵母染色体的中心粒序列 酵母系统的选择标记 大肠杆菌的复制子 大肠杆菌的选择标记 YAC载体的装载量为350 - 400 kb 人造染色体载体 酵母人造染色体（Yeast Artificial Chromosomes YAC） 酵母人造染色体的使用： pYAC4 CEN EcoRI URA TEL BamHI TEL ori Apr TRP ARS EcoRI EcoRI EcoRI BamHI 连接 转化酵母菌 重组酵母染色体 质粒 质粒DNA的分离纯化 碱溶法： 用含有EDTA的缓冲液悬浮菌体 加溶菌酶裂解细菌细胞壁 加NaOH和SDS的混合溶液，去膜释放内含物 加高浓度的醋酸钾溶液，沉淀染色体，去除染 色体DNA及大部分蛋白质 离心取上清液，用苯酚-氯仿萃取，去除痕量的蛋白质 乙醇或异丙醇沉淀水相质粒DNA 用无DNase的RNase去除残余的RNA cccDNA L-DNA ocDNA D-DNA T-DNA 质粒 质粒DNA的分离纯化 沸水浴法： 用含有EDTA和Triton X-100的缓冲液悬浮菌体 加溶菌酶裂解细菌细胞壁 沸水浴40秒钟 离心，用无菌牙签挑去沉淀物 乙醇或异丙醇沉淀质粒DNA 噬菌体或病毒DNA 噬菌体或病毒是一类非细胞微生物，能高效率高特异性地侵染 宿主细胞，然后或自主复制繁殖，或整合入宿主基因组中潜伏 起来，而且在一定的条件下上述两种状态还会相互转化。 噬菌体或病毒的上述特性使得它们的DNA能被开发成为基因工 程的有用载体，因为： 高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞 自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增 噬菌体或病毒DNA 大肠杆菌的 l 噬菌体DNA l 噬菌体的生物学特性： 生物结构 l 噬菌体是大肠杆菌的温和型噬菌体 l 噬菌体由外壳包装蛋白和l-DNA组成 l-DNA全长48502个核苷酸 l-DNA上至少有61个基因 l 噬菌体生物学特性： 生物结构 5’ TCCAGCGGCGGGG 3’ 3’ CCCGCCGCTGGA 5’ COS COS cos 头部合成基因 尾部合成基因 溶菌控制基因 晚期控制基因 DNA合成控制基因 阻遏基因 早期控制基因 阻遏基因 重组基因 删除与整合基因 l - DNA 噬菌体或病毒DNA 大肠杆菌的 l 噬菌体DNA l 噬菌体生物学特性： 感染周期 E.coli 吸附 LamB受体 注入 复制 包装 裂解 噬菌体或病毒DNA 大肠杆菌的 l 噬菌体DNA l 噬菌体生物学特性： 感染周期 体内包装 100个左右的拷贝 包装范围为原DNA的75 - 105% 即 36 - 51 kb D A 噬菌体或病毒DNA 大肠杆菌的 l 噬菌体DNA l 噬菌体生物学特性： 溶原状态 l噬菌体感染大肠杆菌后，除能裂解细胞外，也可能将其DNA直接整合到宿主细胞的染色体DNA上，并不产生子代噬菌体颗粒，这种情况为溶原状态。整合主要由l-DNA上的cI和int两基因的产物所激活，而这两个基因的开放与关闭又取决于宿主细胞本身的性质。人们可以根据需要改变l-DNA或宿主细胞的性质，使噬菌体或处于溶菌状态，或处于溶菌状态 DNA重组技术一般需要l噬菌体进入溶菌状态 噬菌体或病毒DNA 大肠杆菌的 l 噬菌体DNA l-DNA载体的构建：缩短长度 野生型l-DNA包装的上限为51kb，本身长度为48.5kb，只有当插入的外源DNA片段不大于2.5kb时，才能被包装成有感染力的噬菌体颗粒。因此缩短野生型l-DNA的长度，可以提高装载量。其实野生型l-DNA上约有40-50%的片段是复制和裂解所非必需的。根据切除的多少，可将l-DNA分成两大类载体： 插入型载体 取代型载体 噬菌体或病毒DNA 大肠杆菌的 l 噬菌体DNA l-D