流式细胞术——交大版概论.pptx

流式细胞术 ---原理、操作及应用 生物化学与分子细胞生物学系 流式实验室 地址：西7楼107室 电话776423 主要内容 一、流式细胞仪结构和原理 流式细胞术简介 流式细胞仪的光信号检测 流式细胞仪的结构组成 荧光抗体的选择 流式细胞术数据的存贮、显示与分析 二、流式细胞术操作与技巧 三、流式细胞术在生物医学中的应用 1.1 流式细胞术简介 流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞(或生物学颗粒)的理化特性进行多参数定量分析和分选的技术。 流式细胞仪（Flow Cytometer ）是集细胞与分子生物学、流体力学、激光技术、光电子技术、计算机技术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的一种新型高科技仪器。 流式细胞术的特点 检测对象：单细胞悬液或生物颗粒； 检测参数：多参数； 检测特点：单细胞水平分析； 检测速度：高速，最高达上万个细胞/秒； 检测结果：精度高、准确性好； 可对目标细胞进行分选； 流式细胞仪的分类 分析型流式细胞仪 细胞样本分析后最终进入废液桶，不能回收利用。 分选型流式细胞仪 既能流式分析，还能对分析的目的细胞进行分选； 进样管道较长，还需要保持无菌状态，所以分选型流式细胞仪一般只用于分选。 流式细胞仪的发展及商品化 1934 Moldavanl: First try (固定式细胞分析-流动式)； 1953 Crosland-Taylor: 鞘流系统(解决难题)； 1956 Coulter原理(血细胞计数器)； 1965 Kamentsky: 分光光度计定量细胞成分和散射光应用； 1967 Kamentsky等设计了细胞分选的装置； 1969 Vandilla等: 第一台荧光检测细胞计(鞘流聚焦、激光)； 1972 斯坦福大学: 研制出荧光激活细胞分选仪(FACS)； 1973 BD公司与斯坦福大学合作，研制生产第一台商用流 式细胞仪-FACS Ⅰ。 1975 Kohler和Milstein: 单克隆抗体技术(促进流式发展)。 BD公司分析型流式细胞仪 FACS Calibur 双激光四色，市场覆盖率最高 LSR II 双激光六色，三激光八色，四激光十色，分析型最高配 FACS Canto II 双激光六色，三激光八色 FACS Verse双激光六色，三激光八色 BD公司分选型流式细胞仪 FACSVantage SE FACSAria III Influx 1.2 流式细胞术光信号检测 光信号的类型 散射光信号：与标记荧光素无关， 是细胞的固有参数。 前向散射光(forward scatter, FSC); 侧向散射光(side scatter, SSC). 荧光信号 自发荧光 (细胞色素因子、核黄素)：微弱 特异荧光：标记的荧光素分子发出 的荧光，比自发荧光强很多倍。 1.2.1 散射光信号 （一）前向散射光FSC FSC信号方向与激光束平行，偏离度一般在1 -6度范围内，亦称小角度散射光，主要反映被测细胞的体积大小和活力。 （二）侧向散射光SSC SSC方向与激光束和液流形成的平面相垂直，亦称90度散射光，其信号强度反映细胞内部颗粒度和精细结构的变化。 （三）散射光的作用 实验中，常利用FSC和SSC这两种参数的组合，区分不同的细胞群体，去除碎片、死细胞和粘连细胞的干扰。 粒细胞 单核细胞 淋巴细胞 红细胞、死细胞和碎片 死细胞 或碎片 粘连细胞 肿瘤细胞株FSC/SSC散点图 死细胞 加药处理后FSC/SSC散点图 通过FSC/SSC散点图，gate出目标细胞进行分析。 1.2.2 荧光信号 （一）荧光： 物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变为高能状态，再回到低能状态时释放出的光。 发射波长(荧光波长) Emission wavelength 激发波长 Excitation wavelength ＜ （二）常用荧光素 499nm 蓝色荧光（Blue）； 500-549nm，绿色荧光（Green）； 550-584nm，黄色荧光（Yellow）； 585-615nm，橙色荧光（Orange）； 616-700nm，红色荧光（Red）； ≥700nm，远红外荧光（Far-Red）。 标记抗体的荧光素 荧光素分子 激发光波长 （nm） 发射光波长 （nm） 中文名 FITC 490 520 异硫氰酸荧光素 PE 488 575 藻红蛋白 PerCP 490 675 多甲藻叶绿素蛋白 APC 6