荧光实时定量PCR2014资料.pptx

荧光实时定量PCR 4 基本概念 化学原理 1 2 3 等位基因鉴定原理 数学原理 PCR 典型的PCR四阶段 实时荧光定量PCR PCR扩增反应中 对每一个循环产物荧光信号的实时检测 实现对起始模板定量和定性分析 在实时荧光定量PCR反应中，引入一种荧光化学物质， 随着PCR反应的进行，产物不断积累，荧光信号强度也等比增加。 通过检测荧光强度的变化，我们就可以得到荧光扩增曲线 Real-time PCR VS PCR 1.荧光染料掺入的原理？ ——荧光强度与模板的数量成正比 2.如何根据扩增曲线来进行模板的定量分析？ 荧光实时定量PCR技术的产生 1992年由Higuchi等人第一次报告：使用EB加入PCR反应体系，经改装的带有冷CCD的PCR仪检测样品的荧光强度 核酸 ? 染料荧光 后来用与双链DNA有更强结合力的SYBR Green I 取代 EB. 荧光探针杂交技术 两种定量化学 染料染色 SYBR Green I 是一种DNA小沟结合染料 PCR过程中染料的掺入：信号强度与双链DNA分子数正比 扩增曲线 存在的问题 引物扩增的是否是单一的目的基因？ 通过扩增曲线进行目的基因的定量分析 检验方法：熔解曲线 熔解曲线 PCR过程中，可控制温度缓慢升高 (ie. 60oc to 95oc, 0.2oc/sec) dsDNA解链成为ssDN