衍生化hplcms_法测定血浆中超微量炔雌醇.pptVIP

 报 告 人：谭文明 硕士研究生 指导老师：丁 黎 (中国药科大学) 1、论文简介 ： 本论文研究的是复方醋酸环丙孕酮片（达英-35，参比制剂，由德国先灵公司生产，每片含醋酸环丙孕酮（CPA）2 mg和炔雌醇(EE)35 ?g）。 临床用途：用于消除或减轻男性化，治疗痤疮、多毛等皮肤症状，还可降低女性多囊卵巢综合症及用于妇女的避孕。 口服剂量：1片／ 天 炔雌醇是雌二醇的17α-乙炔基衍生物 这里主要讨论丹酰氯柱前衍生化、LC-APCI-MS测定人血浆中pg/ml级炔雌醇的方法 2、血浆中pg/ml级炔雌醇测定方法的介绍 2.1 外国文献报道受试者口服低剂量的炔雌 醇 后，其血药浓度测定常用放射免疫法，最低定量限为8～20 pg·ml-1。 优点：具有较高的检测灵敏度 缺点: 精密度、重现性、准确度都不如LC-MS,GC-MS法。 2.2 外国文献报道GC-MS法测定人血浆中炔雌醇,其LLOQ为10 pg·ml-1。 每个样品分析时间长达几十分钟，并不适合于大批量血浆样本的高通量测定要求。而且该文献并没有炔雌醇人体药代动力学数据。 2.3 外国文献报道采用LC-MS法测定炔雌醇甲醇溶液，LLOQ为50 ng/ml。 我们根据文献初步折算，提取浓缩10倍后其血药浓度LLOQ最多为5 ng/ml。 距离血药浓度为10 pg/ml的要求相差了500倍。 2.4 我们的初步尝试 我们仍然采用较为普及的LC-ESI-MS, LC-APCI-MS单级质谱测定炔雌醇的甲醇溶液。 检测离子:[M-H]- 结果与外国文献报道相近，LLOQ为30 ng·ml-1，远远达不到检测的要求,有300倍的差距。 3、难点：人血浆中pg/ml级炔雌醇的测定 如何利用现有的、比较普及的LC-MS测定pg/ml的炔雌醇呢？ 3.1 衍生化试剂-丹酰氯的分子结构： 3.2 丹酰氯的应用介绍 含有伯、仲胺基、酚羟基的化合物 3.3 常识：含有仲、叔氮原子的化合物由于碱性较强，在质谱测定中易于结合氢离子，化合物的质子化效率较高。 恰好丹酰氯分子中含有叔氮原子，磺酰氯基能与炔雌醇的酚羟基发生反应。 而丹酰氯作为衍生化试剂提高化合物离子化效率而增强质谱响应却未见报道。 我们考虑用丹酰氯将炔雌醇衍生化后，引入碱性较强的叔氮原子。将质谱响应较低的酚羟基，转变为响应很强的叔氮原子，产生新的质谱响应活性中心。 3.4 炔雌醇的丹酰氯衍生化方程式： 3.5 对羟基联苯(内标)的衍生化方程式： 3 6 新的检测离子的产生 结果如前所料： 衍生化以后，炔雌醇和内标引入了丹酰氯的叔氮原子，其碱性较强，所以与H+形成[M+H]+正离子。 3.7.1 炔雌醇的丹酰氯衍生物正离子质谱扫描图 3.7.2 内标的丹酰氯衍生物正离子质谱扫描图 6 血浆样品中炔雌醇的LC-MS测定法的建立与考证 实验条件 血浆样品的处理 炔雌醇的本底 方法特异性 方法学实验结果 6.1 实验条件 色谱条件 流动相：甲醇：含1%甲酸的10mmol/L醋 酸铵水溶液=97：3 色谱柱：Lichrospher C18 dp 5μ 4.6 mm ID×25 cm (淮阴汉邦科技) 流 速：1 ml/min 柱 温：25 ℃ 质谱条件 MSD：选择性离子监测； 离子极性：正离子； 离子化方式：大气压化学离子（APCI）； 检测对象： 炔雌醇的衍生物，[M+H]+，m/z 530.3； 内标的衍生物， [M+H]+，m/z 403.3； 传输区电压 ：150 V 干燥气流速 ：4.0 L·min-1; 雾化室压力 ：60 psig 干燥气温度 ：350℃。 6.2 血浆样品的处理 血浆样品 1.0 ml →内标(20ng/ml)50 ul → 涡旋混匀 → 乙酸乙酯5 ml → 涡旋 3 min →3000r/min, 离心10 min 6.3 残渣衍生化反应的详细步骤 提取残渣 →100 mmol·L-1的碳酸氢钠缓冲液100?l （2 mol·L-1氢氧化钠水溶液调节至pH10.5） →加塞 →涡旋1 min →加入3 mg·ml-1的丹酰氯丙酮溶液100?l →加塞 →涡旋1 min →55℃水浴反应50 min。 6.4 炔雌醇的本底 外国文献报道，没有服用炔雌醇人体内也可能会存在一定浓度的本底。