三代基因组编辑技术课件.ppt

锌指核糖核酸酶（ZFN） 由一个 DNA 识别域和一个非特异性核酸内切酶构成。DNA 识别域是由一系列 Cys2-His2锌指蛋白（zinc-fingers）串联组成（一般 3~4 个），每个锌指蛋白识别并结合一个特异的三联体碱基。锌指蛋白源自转录调控因子家族（transcription factor family），在真核生物中从酵母到人类广泛存在，形成alpha-beta-beta二级结构。其中alpha螺旋的16氨基酸残基决定锌指的DNA结合特异性，骨架结构保守。对决定DNA结合特异性的氨基酸引入序列的改变可以获得新的DNA结合特异性。 现已公布的从自然界筛选的和人工突变的具有高特异性的锌指蛋白可以识别所有的GNN和ANN以及部分CNN和TNN三联体。多个锌指蛋白可以串联起来形成一个锌指蛋白组识别一段特异的碱基序列，具有很强的特异性和可塑性，很适合用于设计ZFNs。与锌指蛋白组相连的非特异性核酸内切酶来自FokI的C端的96个氨基酸残基组成的DNA剪切域(Kim et al., 1996)。FokI是来自海床黄杆菌的一种限制性内切酶，只在二聚体状态时才有酶切活性(Kim et al., 1994)，每个FokI单体与一个锌指蛋白组相连构成一个ZFN，识别特定的位点，当两个识别位点相距恰当的距离时（6~8 bp），两个单体ZFN相互作用产生酶切功能。从而达到 DNA 定点剪切的目的。 DNA的剪切需要两个FokI切割区域的二聚化，和至少一个单元结合DNA。因为二聚化的过程是独立于DNA剪切的，异二聚体的形成，和两种单元所形成的同源二聚体，同样可以造成DNA的剪切，并且他们有着不同的识别序列。可以想象，具有较低特异性的同源二聚体形式的ZFN会切割基因组中的假回文序列。而且，在某些特定条件下，单一ZFN单元结合于DNA（识别序列只有9~12 bp）也会造成DNA的剪切。如此，两个不同的ZFN单元总共可能产生七种不同识别序列的内切酶。这些非特异性行为均可能带来ZFN毒性。 * * TALEN 技术是一种崭新的分子生物学工具。科学家发现，来自一种植物细菌的TAL蛋白的核酸结合域的氨基酸序列与其靶位点的核酸序列有恒定的对应关系。利用TAL的序列模块，可组装成特异结合任意DNA序列的模块化蛋白，从而达到靶向操作内源性基因的目的，它克服了ZFN方法不能识别任意目标基因序列，以及识别序列经常受上下游序列影响等问题，而具有ZFN相等或更好的灵活性，使基因操作变得更加简单方便。然而同样因为脱靶的问题，利用TALEN技术进行小鼠的基因修饰仍然无法取代传统技术 (A) Schematic of TALENs used in the study. Full-length TALEs were fused with the homodimeric cleavage domain of FokI (FN). The number of amino acids in the separate domains is shown above each region (NLS, nuclear localization motifs; AD, transcription activation domain). (B) Target sequences between the first and second codons of the yeast URA3 gene targeted for cleavage by hybrid TALENs derived from AvrXa7 and PthXo1 ZFN和TALEN能够识别并结合特异的DNA序列，并高效精确地造成DSB。随后细胞利用天然的DNA修复过程来实现DNA的插入、删除和修改，这样研究人员就能够随心所欲地进行基因组编辑。这在过去是无法想象的，传统的基因敲除技术依赖细胞内自然发生的同源重组，其效率只有百万分之一，而ZFN的基因敲除效率能达到10%并且所需要的同源臂长度可从8kb缩短到2kb。 1.主要是对外来信息的处理和加工，形成免疫记忆，也就是新的间隔序列的获得，主要由通用的核心蛋白Cas1和Cas2参与完成 2.主要为初级CRISPR RNA成熟以及识别和降解入侵的外源遗传物质 * This slide shows how CRISPR target specific DNA. Firstly, mature crRNA that is base-paired to trans-activating crRNA (tracrRNA) forms a two-RNA structure, which determines the specificity; then it combines