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pUC18和pUC19载体 Ampr ori pUC18 (3 kb) MCS (Multiple cloning sites, 多科隆位点） Lac promoter lacZ’ 第二节 噬菌体载体 （Bacteriophage，简称phage） DNA Protein coat cos cos Nonessential region Long (left) arm short (right) arm Exogenous DNA (~20-23 kb) λ phage 12bp λ噬菌体插入载体 λ噬菌体载体相对于质粒载体来说，克隆片段较大，所以一般用于cDNA文库或基因组文库的构建。 cI基因和imm434基因插入失活：如λ gt10、λNM1149等载体，在cI基因上有EcoR I及Hind III的酶切位点。外源基因插入后将导致cI基因的失活。cI基因失活后将导致噬菌体不能溶原化，产生清晰的噬菌斑。相反，产生混浊的噬菌斑。 Lac Z基因插入失活：如charon16A载体，在非必须区段引入lac Z基因，在lac Z基因上有EcoR I位点，插入失活后利用X-gal法筛选（兰白筛选）。 分子克隆载体的选择 1. 选择克隆载体的几个重要参数 （1）实验对象 （2）实验性质 （3）载体容量 （4）合适克隆位点 （5）载体的稳定性 （6）载体DNA制备的难易 （7）外源基因表达产物产量、产物特点等 2.?实验对象 （1）供体：遗传背景与DNA特点等，其中包括染色体DNA大小，基因大小与结构，碱基组成，目的基因的产物特点以及遗传物质的传递方式等。 （2）受体：各种中间宿主与终宿主的遗传背景，如遗传物质的传递方式(包括人为的方法)，DNA限制修饰系统，DNA重组基因特点，基因产物修饰系统，即转录与翻译后修饰系统。 如常用于基因工程的宿主菌E.coli，菌株不同，基因型亦不同，不同载体要求不同菌株。如： E.coli DH5、 E.coli DH5α、 E .coliDH5αF’ 1）?三者均有限制-修饰系统和重组基因缺陷，外源DNA可存活，且不发生重组 2）?DH5α和 DH5αF’都具有一个可供遗传标记lacZα检测的遗传背景 3）?DH5αF’可供M13mp系列载体配套使用，M13病毒的感染需要 F’的存在 3. 实验性质 分子克隆的一般程序包括以下几步： （1）分离供体DNA或RNA（mRNA）和载体DNA （2）构建基因文库或cDNA文库 （3）目的基因或cDNA 克隆的筛选 （4）目的基因或cDNA片段的鉴定：限制酶谱，亚克隆，核苷酸序列分析，基因结构分析等 （5）基因表达与调控机理的研究 1) 建立文库用载体 常在E.coli 进行 i.目的基因与供体基因大小 小—质粒载体，操作方便，鉴定简单 大—λ或cos质粒载体, 甚至pYAC载体(为减少文库规模，即使基因组小的也可用λ和cos载体） ii.筛选方法 ⅰ)互补法：可表达,选一般载体;不表达，选表达载体(外源基因必须表达，表达产物必须具备活性) ⅱ)免疫法：与上同，但表达产物不一定具生物活性 ⅲ)杂交法：各种载体均可 2) 目的基因的鉴定 次克隆：选用质粒载体，限制酶谱分析，基因结构分析等 测序：测序载体（M13mp系列），其他质粒载体（如pUC系列，pBR322，T3，T7，SP6启动子载体） 3) 基因表达与调控 表达型（分泌）载体 Vectors in Genetic Engineering 载体 （Vectors） 在基因工程操作中，把能携带外源DNA进入受体细胞的DNA分子叫载体。 载体的功能 运送外源基因高效转入受体细胞 为外源基因提供复制能力 为外源基因的扩增或表达提供必要条件 基因工程对载体 的要求： 复制起点，在特定宿主细胞内能复制。 self replicate 选择性标记，便于筛选和鉴定。 marker genes (antibiotic Resistance ) for easy identification of cells containing the vector 多克隆位点（ multiple cloning sites ， MCS），外源DNA插入其中不影响载体的复制。 启动子promoter（表达载体必需） 前三个条件必不可少。 分子量小，拷贝数多；容易从宿主细胞中分 离纯化。 与特定细胞有相容性，即可转移性 从安全角度考虑，要求载体不能自发转移，仅限于在某些实验室内特殊菌种内才可复制。 容纳较大的外源DNA 能力 reasonable size and circular 质粒（pla