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六、PCR扩增产物的分析 1、凝胶电泳分析法： 聚丙烯酰胺凝胶电泳灵敏度远高于琼脂糖电泳， 用于探讨PCR扩增的灵敏度效果好，但配制复杂， 常用琼脂糖凝胶电泳。 2、点杂交 3、微孔板杂交法 七、PCR技术的主要用途 1、目的基因的克隆： 　　PCR技术为在重组DNA过程中获得目的基 　　因片段提供了简便快速的方法。 2、基因的体外突变： 　　　　可以随意设计引物在体外对目的基因片段 　　进行嵌和、缺失、点突变等改造。 3、DNA和RNA的微量分析： 　　　PCR技术高度敏感，对模板ＤＮＡ的含量 　要求很低，是DNA和ＲNA微量分析的最好方 　法。实际工作中，一滴血液、一根毛发或一个细 　胞已足以满足PCR的检测需要，因此在基因诊 　断方面具有极广阔的应用前景。 4、DNA序列测定： 　　　PCR技术的引入使DNA测序工作大大简化， 　也提高了测序的速度。 5、基因突变分析： 　　　利用PCR与一些技术的结合可以大大提高 　基因突变检测的敏感性。 聚合酶链式反应（PCR） 中心实验室 刘世海 一、PCR的定义： PCR（polymerase chain reaction) ： 聚合酶链式反应， 是一项在短时间内选择性体外大量扩增特定的ＤＮＡ片段的分子生物学技术。又称体外DNA扩增技术。 DNA扩增的传统方法： 一般采用分子克隆法，需将构建的含有目的基因的载体导入细胞进行扩增，并需要用探针进行筛选，牵扯到DNA酶切、连接、转化、培养及探针杂交等技术，虽然技术上已无难点，但操作复杂，需数周到数月的时间，且不利于普及。 PCR技术：1985年由美国 Cetus 公司的Kary Mullis 首创，可以将微量目的DNA片段扩增一百万倍以上。 优点：敏感度高、特异性强、产率高、重复性好以及快速简便等，广泛应用于微生物学、考古学、法医学及体育等领域，并已普及到许多普通实验室，大大简化了传统的分子克隆技术，从而比较容易地对目的基因进行分析、鉴定。 Kary Mullis 本人因此获1993年诺贝尔化学奖。 二、PCR的原理： 用于扩增位于两段已知序列之间的DNA片段，类似于天然DNA的复制过程。 以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板5′末端和3′末端互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成，重复这一过程，即可使目的DNA片段得到扩增。 扩增的特异性取决于引物与模板DNA的特异结合，基本反应步骤分三步： 1. 变性 (Denaturation)： 加热使模板DNA双链间的氢键断裂而形成两条单链。94℃ 30″ 2. 退火 (复性) (Annealling): 突然降温后模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合，也存在两条模板链之间的结合，但由于引物的高浓度，结构简单的特点，主要的结合发生在模板与引物之间。55 ℃ 30 ″ 3. 延伸 (Extension): 将反应温度调节到酶的最适温度，在DNA聚合酶、4种 dNTPs 及镁离子等存在的条件下，以引物的 3′ 端开始，结合单核苷酸，形成与模板链互补的新DNA链。72 ℃ 1′ 上述 3 步为一个循环，每经过一个循环，样本中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过25～40个循环后DNA可扩增106 ～ 109 倍。 PCR 的基本反应步骤 变性 95?C 延伸 72?C 退火 Tm-5?C 94℃变性 50-65℃退火 72℃延伸 PCR扩增原理 引物 延伸 延伸 5’ 5’ 3’ 3’ 变性、退火 变性、退火 PCR扩增的特异性是由一对寡核苷酸引物所决定的。反应初期，原来的DNA担负起使模板的作用，随着循环次数的递增，由引物介导延伸的片段急剧增多而成为主要模板，最终的扩增产物是介于两种引物5’ 端之间的DNA片段。 三、PCR的成分和作用：终浓度 1. 缓冲液： 10 ～ 50 mM Tris- Cl (pH8.4) 维持 Taq 酶作用环境的偏碱性 25 ～ 50 mM KCl 促进引物退火，50 mM 会抑制 Taq 酶的活性。 100μg / ml 牛血清白蛋白 (